Стандартна процедура калібрування поляризаторів у поляризаційному мікроскопі
Флуоресцентний мікроскоп відрізняється від звичайного оптичного мікроскопа тим, що він не спостерігає зразки під освітленням звичайних джерел світла. Замість цього він використовує певну довжину хвилі світла (зазвичай ультрафіолетове світло, синьо-фіолетове світло), щоб збудити флуоресцентні речовини всередині зразка під мікроскопом, змушуючи їх випромінювати флуоресценцію. Тому роль джерела світла у флуоресцентному мікроскопі полягає не в прямому освітленні, а в якості джерела енергії для збудження флуоресцентних речовин усередині зразка. Причина, чому ми можемо спостерігати за зразками, полягає не в освітленні джерела світла, а в явищі флуоресценції, яке виявляють флуоресцентні речовини всередині зразка після поглинання збудженої енергії світла. Звідси видно, що характеристика флуоресцентної мікроскопії в основному полягає в тому, що її джерело світла може постачати велику кількість збуджуючого світла в певному діапазоні довжин хвиль, так що флуоресцентні речовини в зразку можуть отримати необхідну інтенсивність збуджуючого світла. При цьому люмінесцентні мікроскопи повинні мати відповідні системи фільтрів. Флуоресцентний мікроскоп є основним інструментом у хімії флуоресцентної тканини. Він складається з основних компонентів, таких як над-джерело світла високої напруги, система фільтрів (включаючи пластини фільтрів збудження та придушення), оптична система та система фотографії. Він використовує світло певної довжини хвилі для збудження зразка та випромінювання флуоресценції.
1. Методи збудження флуоресценції. Відповідно до діапазону довжин хвиль світла існує два типи: метод збудження УФ (з використанням ультрафіолетового освітлення) і метод збудження BV (з використанням синьо-фіолетового світла). У методі УФ-збудження для збудження використовується ближнє ультрафіолетове світло, коротше 400 нм. У цьому методі немає видимого збуджуючого світла, тому спостережувана флуоресценція демонструє притаманну флуоресценцію барвника, що дозволяє легко відрізнити специфічну флуоресценцію на зразку від власної флуоресценції фонової тканини.
2. Метод збудження BV: він передбачає збудження від ультрафіолетового до синього світла з центром на 404 нм і 434 нм. У цьому методі для опромінення зразка використовується синє світло, тому -відсікаючий фільтр системи спостереження флуоресценції має використовувати фільтр, який може повністю блокувати синє світло та повністю пропускати необхідну зелену та жовту флуоресценцію. Флуоресцентні пігменти, що використовуються для методу флуоресцентних антитіл. Максимальна довжина хвилі поглинання збуджуючого світла та максимальна довжина хвилі випромінювання флуоресценції є відносно близькими, тому фільтр, який використовується в методі збудження BV, повинен використовувати різкий фільтр. Цей метод може використовувати синє світло як світло збудження, тому ефективність поглинання флуоресцентних пігментів висока, і можна отримати яскравіші зображення. Недоліком є те, що флуоресценцію нижче 500 нм неможливо побачити, тоді як флуоресценція вище 500 нм робить все зображення жовтим. У методі флуоресцентних антитіл специфічність здебільшого визначається кольором, унікальним для флуоресцентних пігментів, тому, обговорюючи тонку специфічність, згадані вище недоліки методу збудження BV часто мають значний вплив.
