Принципи конфокальної мікроскопії
Конфокальний мікроскоп — це високоточний інструмент для отримання зображень, який з’явився та розроблений у 1980-х роках і є важливим науковим інструментом для вивчення субмікронних структур. З розвитком комп’ютерів, програмного забезпечення для обробки зображень і лазерів конфокальні мікроскопи також зазнали значного розвитку і зараз широко використовуються в галузі біології, мікросистем і вимірювання матеріалів. Конфокальний мікроскоп — це новий тип мікроскопа, що поєднує конфокальний принцип, технологію сканування та технологію обробки комп’ютерної графіки. Його головними перевагами є: висока бокова роздільна здатність і висока аксіальна роздільна здатність, а також ефективне придушення розсіяного світла з високою контрастністю.
Типова установка конфокального мікроскопа полягає в розміщенні двох маленьких отворів на спряженій площині фокальної площини вимірюваного об’єкта, один з яких розміщений перед джерелом світла, а інший – перед детектором, як показано на малюнку. 1. На малюнку видно, що коли вимірюваний зразок знаходиться в квазіфокусній площині, інтенсивність світла, зібраного кінцем детектування, є найбільшою; коли вимірюваний зразок знаходиться поза фокусом, світлова пляма на кінці детектування розсіюється, і інтенсивність світла швидко зменшується. Таким чином, тільки світло, випромінюване точками на фокальній площині, може проходити через вихідний отвір, тоді як світло, випромінюване точками поза фокальною площиною, розфокусується на площині вихідного отвору, і більшість із них не може пройти через центральний отвір. Таким чином, цільова точка спостереження на фокальній площині виглядає яскравою, а неспостережувана точка виглядає чорною як фон, підвищуючи контраст і чіткіше зображення. Під час процесу візуалізації дві точкові отвори є конфокальними, конфокальна точка є виявленою точкою, а площина, де розташована виявлена точка, є конфокальною площиною.
Розмір отвору на детекторі в конфокальній мікроскопії відіграє вирішальну роль. Це безпосередньо впливає на роздільну здатність і співвідношення сигнал/шум системи. Якщо отвір занадто великий, ефект конфокального виявлення не буде досягнутий, що не тільки зменшує роздільну здатність системи, але також вводить більше розсіяного світла; якщо отвір занадто малий, це зменшить ефективність виявлення та зменшить мікроскопічне зображення. яскравість. Дослідження показали, що коли діаметр отвору дорівнює діаметру диска Ейрі, конфокальні вимоги виконуються, а ефективність виявлення суттєво не знижується. Оскільки діаметр отвору, як правило, становить мікрони, якщо існує відхилення між точкою фокусування лазерного променя та положенням отвору, виникне спотворення сигналу. Тому в конфокальних мікроскопах зазвичай використовується система автофокусування, що практично збільшує час вимірювання.
Оскільки лазерний конфокальний скануючий мікроскоп є точковим, то для отримання двовимірного зображення об'єкта необхідно використовувати двовимірне сканування в напрямках x і y. У різних мікроскопах використовуються різні методи сканування:
(1) Сканування об'єктів. Тобто сам предмет рухається за певним законом, а світловий промінь залишається незмінним. Переваги: стабільний оптичний шлях; Недоліки: потрібен великий скануючий стіл, тому швидкість сканування сильно обмежена.
(2) Система сканування променя формується за допомогою відбивного гальванометра. Тобто, керуючи скануючим гальванометром, сфокусована світлова пляма регулярно відбивається на певний шар об’єкта для завершення двовимірного сканування. Його перевага полягає в тому, що він має високу точність і часто використовується для високоточних вимірювань. Швидкість сканування покращилася порівняно зі скануванням об’єктів, але вона все ще невисока.
(3) Використовуйте акустооптичний відхиляючий елемент для сканування, і сканування здійснюється шляхом зміни вихідної частоти звукової хвилі, а потім зміни напрямку передачі світлової хвилі. Його видатна перевага полягає в тому, що швидкість сканування дуже висока. Система сканування, розроблена Сполученими Штатами, використовує акустооптичний дефлектор для створення відеозображень у реальному часі. Сканування двовимірного зображення займає лише 1/30 с, і це майже забезпечує вихід у реальному часі.
(4) Сканування диска Ніпкова. Процес сканування завершується обертанням диска Ніпкова, утримуючи інші компоненти нерухомо. Це може бути зображено за один раз, і швидкість дуже висока. Однак, оскільки промінь зображення є позаосьовим світлом, необхідно виправити позаосьову аберацію лінзи, а коефіцієнт використання світлової енергії дуже низький.
