Підготовка та спостереження біологічних зразків для електронної мікроскопії
Роздільна здатність мікроскопа залежить від довжини хвилі використовуваного світла. Електронний мікроскоп, який почав з’являтися в 1933 році, використовує електронний промінь з довжиною хвилі, набагато меншою за довжину хвилі видимого світла, як джерело світла, тому роздільна здатність, яку він може досягти, значно покращується порівняно з роздільною здатністю оптичного мікроскопа. Різниця в джерелах світла також визначає низку відмінностей між електронними мікроскопами та оптичними мікроскопами.
Відповідно до відмінностей у принципах візуалізації електронного променя та різних способів впливу на зразки, сучасні електронні мікроскопи розвинулися в багато типів. В даний час найбільш поширеними є трансмісійні електронні мікроскопи та скануючі електронні мікроскопи. Загальне збільшення першого може бути між 1000-1000000. Загальне збільшення останнього може коливатися від 20 до 300,000 разів. Цей експеримент в основному представляє підготовку двох типів зразків мікроскопа, трансмісійного електронного мікроскопа та скануючого електронного мікроскопа.
2. Обладнання
1. Бактерії кишкової палички (Escherichia coli) похил.
2. Розчин або реактив амілацетат, концентрована сірчана кислота, абсолютний етанол, стерильна вода, 2% водний розчин фосфорновольфрамату натрію (pH 6.5-8.0), 0.3% поліетилену. розчин формальдегіду (розчинний у хлороформі), клітини Пігмент c, ацетат амонію, плазміда pBR322.
3. Інструменти або інший посуд: звичайний оптичний мікроскоп, мідна сітка, порцелянова лійка, склянка, чашка, стерильні крапельниці, стерильні пінцети, шпильки, предметні скла, лічильна дошка, машина для вакуумного нанесення покриттів, сушарка для критичної точки тощо.
3. Етапи операції
(1) Підготовка зразків і спостереження для трансмісійної електронної мікроскопії
1. Обробка металевої сітки
Зразок для оптичної мікроскопії поміщають на предметне скло для спостереження. Однак у трансмісійній електронній мікроскопії, оскільки електрони не можуть проникнути через скляний лист, сітчасті матеріали можна використовувати лише як носії, які зазвичай називають сітками-носіями. Несучу сітку можна розділити на багато різних специфікацій через різні матеріали та форми, серед яких найчастіше використовується 200-400 сітка (кількість отворів) мідна сітка. Перед використанням мідну сітку необхідно обробити, щоб видалити бруд і підтримувати її в чистоті, інакше це вплине на якість плівки-підтримки та чіткість фотографій зразків. У цьому експерименті використовується 400-сітчаста мідна сітка, яку можна обробляти таким чином: спочатку замочіть і відбіліть її амілацетатом на кілька годин, потім кілька разів промийте дистильованою водою, а потім замочіть в абсолютному етанолі на зневоднення. Якщо після вищевказаних методів мідна сітка все ще не чиста, ви можете замочити її в розведеній концентрованій сірчаній кислоті (1:1) на 1-2 хвилини або прокип’ятити в 1% розчині NaOH протягом декількох хвилин, промити її дистильованою води кілька разів, а потім помістіть його в безводний дегідрат в етанолі та відставте.
2. Підготовка опорної мембрани
Під час спостереження за зразками несучу сітку також слід покрити шаром неструктурованої однорідної плівки, інакше невеликі зразки будуть витікати з отворів несучої сітки. Цю плівку зазвичай називають опорною або несучою. Опорна плівка має бути прозорою для електронів, а її товщина, як правило, повинна бути менше 20 нм; під впливом електронного променя плівка також повинна мати певну механічну міцність для збереження структурної стабільності та мати хорошу теплопровідність; крім того, підтримуюча мережа повинна використовуватися в електронній мікроскопії. Під нею не повинно бути видимої структури, хімічної реакції зі зразком, що переноситься, і ніяких перешкод для спостереження за зразком. Його товщина зазвичай становить близько 15 нм. Несучою плівкою може бути пластикова плівка (така як колодієва плівка, поліетиленформальдегідна плівка тощо), вугільна плівка або металева плівка (така як берилієва плівка тощо). За звичайних умов роботи пластикова плівка може відповідати вимогам. Серед пластикових плівок колодієву плівку відносно легко приготувати, але її міцність не така висока, як поліетиленформальдегідна плівка.
