Знання, пов’язані з флуоресцентним мікроскопом
Основний принцип конфокальної флуоресцентної мікроскопії: для опромінення зразка використовується точкове джерело світла, на фокальній площині формується чітка невелика світлова пляма. складається з розгалужувачів. Розділювач променя направляє флуоресценцію безпосередньо на детектор. Перед джерелом світла та детектором є отвір-точка, яка відповідно називається точкою освітлення та точкою виявлення. Геометричний розмір обох є однаковим, близько 100-200 нм; по відношенню до світлової плями на фокальній площині, вони є сполученими, тобто світлова пляма проходить через серію лінз і, нарешті, може бути сфокусована на точці освітлення та точці виявлення одночасно. Таким чином, світло з фокальної площини може зводитися в межах отвору виявлення, тоді як розсіяне світло зверху або під фокальною площиною блокується за межами отвору виявлення і не може бути зображено. Лазер сканує зразок точка за точкою, а фотопомножувач після виявлення отвору також отримує конфокальне зображення відповідної світлової точки точка за точкою, яке перетворюється на цифровий сигнал і передається на комп’ютер, а потім агрегується в чітке зображення. конфокальне зображення всієї фокальної площини на екрані.
Кожне зображення у фокальній площині насправді є оптичним поперечним перерізом зразка, і цей оптичний переріз завжди має певну товщину, також відому як оптичний тонкий зріз. Оскільки інтенсивність світла в фокальній точці набагато більша, ніж у нефокусній точці, а світло нефокальної площини фільтрується отвором, глибина різкості конфокальної системи приблизно дорівнює нулю, а сканування вздовж Z -вісь може реалізувати оптичну томографію, утворюючи двовимірний оптичний розріз у сфокусованій точці зразка. Поєднуючи сканування площини XY (фокальної площини) зі скануванням осі Z (оптичної осі), тривимірне зображення зразка може бути отримано шляхом накопичення двовимірних зображень безперервних шарів і оброблених спеціальним комп’ютерним програмним забезпеченням.
Тобто отвір виявлення та отвір джерела світла завжди сфокусовані в одній точці, тому флуоресценція, збуджена за межами фокальної площини, не може потрапити в отвір виявлення.
Просте вираження принципу роботи конфокального лазера полягає в тому, що він використовує лазерне світло як джерело світла. На основі традиційної флуоресцентної мікроскопічної візуалізації він додає лазерний скануючий пристрій і сполучений фокусуючий пристрій, і це система для отримання та обробки цифрових зображень за допомогою комп’ютерного керування.
