Порівняння між конфокальним мікроскопом і звичайним оптичним мікроскопом
Загальний оптичний мікроскоп
Загальний біологічний мікроскоп складається з трьох частин, а саме: ① система освітлення, включаючи джерело світла та конденсор; ② Система оптичного підсилення, яка складається з об’єктива та окуляра, є основним корпусом мікроскопа. Щоб усунути сферичну та хроматичну аберації, окуляр і лінза об’єктива складаються зі складних груп лінз; (3) механічний пристрій, що використовується для фіксації матеріалів і зручного спостереження.
Чітке зображення мікроскопа чи ні залежить не тільки від збільшення, а й від роздільної здатності мікроскопа. Роздільна здатність означає здатність мікроскопа (або місця, де очі людини знаходяться на відстані 25 см від цілі) розрізняти невеликий інтервал zui об’єкта. Роздільна здатність залежить від довжини світлової хвилі, світлосили та показника заломлення середовища, який виражається формулою:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
Де: n= показник заломлення середовища;=кут дзеркала (кут відкриття зразка до апертури лінзи) і NA= числова апертура. Кут дзеркала завжди менше 180? Тому значення zui sina/2 має бути менше 1.
Показник заломлення скла, що використовується для виготовлення оптичних лінз, становить 1,65~1,78, і показник заломлення середовища, що використовується, чим ближчий до показника скла, тим краще. Для сухого об’єктива середовищем є повітря, а діафрагма зазвичай становить 0.05 ~ 0,95; Масляна лінза використовує ароматний асфальт як середовище, а швидкість відкриття лінзи може бути близькою до 1,5.
Довжина хвилі звичайного світла становить 400~700 нм, тому роздільна здатність мікроскопа становить не менше 0,2 мкм, а роздільна здатність людського ока становить 0,2 мм, тому велике збільшення zui розроблено загальний мікроскоп зазвичай 1000X x.
Для чого потрібен конфокальний мікроскоп?
1. Оптичний мікроскоп був вдосконалений зусиллями та вдосконаленням наших великих попередників. Насправді звичайні мікроскопи можуть просто й швидко надати нам чудові мікроскопічні зображення. Однак сталася подія, яка принесла революційну інновацію в цей майже ідеальний світ мікроскопів, а саме винахід «лазерного скануючого конфокального мікроскопа». Цей новий мікроскоп характеризується використанням оптичної системи, яка лише витягує інформацію про зображення в площині, де зосереджено фокус, і відновлює отриману інформацію в пам’яті зображення під час зміни фокусу, щоб отримати яскраве зображення з повною тривимірною інформацією. можна отримати. За допомогою цього методу можна просто отримати інформацію про форму поверхні, яку не можна підтвердити звичайними мікроскопами. Крім того, для звичайних оптичних мікроскопів «підвищення роздільної здатності» і «поглиблення глибини фокусу» є суперечливими умовами, особливо при великому збільшенні, але для конфокальних мікроскопів ця проблема вирішувана.
2. Переваги конфокальної оптичної системи
Конфокальна оптична система освітлює точку зразка, а відбите світло також сприймається точковими рецепторами. Коли зразок знаходиться у фокусі, майже все відбите світло може досягти фоторецептора, але коли зразок відхиляється від фокусу, відбите світло не може досягти фоторецептора. Тобто в конфокальній оптичній системі буде виведено лише зображення, яке збігається з фокусом, а факелу та непотрібне розсіяне світло будуть екрановані.
3. Для чого використовують лазер?
У конфокальній оптичній системі зразок освітлюється, а відбите світло також приймається точковим фоторецептором. Тому точкове джерело світла стає необхідним. Лазер належить до дуже точкових джерел світла. У більшості випадків джерелом світла конфокального мікроскопа є лазерне джерело світла. Крім того, такі характеристики лазера, як монохроматичність, спрямованість і відмінна форма променя, також є важливими причинами його широкого використання.
4. Стає можливим спостереження в режимі реального часу на основі високошвидкісного сканування.
У лазерному скануванні акустичний оптичний дефлектор (основний елемент АО) використовується в горизонтальному напрямку, а сервогальвано-дзеркало використовується у вертикальному напрямку. Оскільки в блоці акустичного оптичного відхилення немає механічної вібраційної частини, він може сканувати на високій швидкості, і це можна спостерігати в режимі реального часу на екрані моніторингу. Висока швидкість цієї камери є дуже важливим проектом, який безпосередньо впливає на швидкість фокусування та визначення положення.
5. Зв’язок між положенням фокуса та яскравістю
У конфокальній оптичній системі, коли зразок правильно розміщений у положенні фокусу, яскравість велика, а до і після неї його яскравість різко падає (суцільна лінія на малюнку 4). Ця чутлива селективність фокальної площини також є принципом вимірювання напрямку висоти конфокального мікроскопа та розширення фокусної глибини. Навпаки, звичайний оптичний мікроскоп не має явної зміни яскравості до і після положення фокуса (пунктирна лінія на малюнку 4).
6. Висока контрастність і висока роздільна здатність
У загальному оптичному мікроскопі відбите світло, що відхиляється від фокуса, буде заважати, і воно буде накладатися на частину зображення фокусу, таким чином зменшуючи контраст зображення. Навпаки, у конфокальній оптичній системі розсіяне світло поза фокусом і розсіяне світло всередині лінзи об’єктива майже повністю видаляються, тому можна отримати зображення з дуже високим контрастом. Крім того, оскільки світло проходить крізь об’єктив двічі, точкове зображення спочатку стає різкішим, а роздільна здатність мікроскопа також покращується.
7. Функція оптичної локалізації
У конфокальній оптичній системі відбите світло від частини, відмінної від фокальної точки, екранується мікропорами. Тому при спостереженні за тривимірним зразком формується зображення, подібне до того, що утворюється після розрізання зразка з фокусом (рис. 5). Цей ефект називається оптичною локалізацією, яка відноситься до однієї з особливостей конфокальної оптичної системи.
8. Функція пам'яті для переміщення фокуса
Так зване відбите світло поза фокусом екранується мікропорами. З іншого боку, можна вважати, що всі точки на зображенні, сформованому конфокальною оптичною системою, збігаються з фокусом. Отже, якщо тривимірний зразок переміщати вздовж осі Z (оптичної осі), зображення буде накопичуватися та зберігатися в пам’яті, і zui в кінцевому підсумку отримає зображення, сформоване збігом усього зразка та фокусу . Таким чином, функція нескінченної глибини фокусування називається функцією мобільної пам'яті.
9. Функція вимірювання форми поверхні
У функції переміщення фокуса форму поверхні зразка можна виміряти безконтактним способом, додавши петлю для запису висоти. На основі цієї функції можна записати координати осі Z, утворені великим значенням яскравості zui в кожному пікселі, і на основі цієї інформації можна отримати інформацію, пов’язану з формою поверхні зразка.
10. Високоточна функція вимірювання мікророзміру
Блок приймання світла використовує одновимірний датчик зображення CCD, тому на нього не впливає нахил скануючого пристрою, щоб можна було виконати високоточні вимірювання. Крім того, оскільки одночасно використовується функція пам’яті переміщення фокуса з регульованою глибиною фокусування, можна усунути помилку вимірювання, спричинену зсувом фокусу.
11. Аналіз тривимірного зображення
Використовуючи функцію вимірювання форми поверхні, можна легко створити тривимірне зображення поверхні зразка. Не тільки це, але також можна виконувати багато видів аналізу, наприклад: вимірювання шорсткості поверхні, площа, об’єм, площа поверхні, круглість, радіус, довжина zui, периметр, центр ваги, томографічне зображення, перетворення ШПФ, лінія вимірювання ширини тощо.
Лазерний конфокальний скануючий мікроскоп можна використовувати не тільки для спостереження за морфологією клітин, але й для кількісного аналізу біохімічних компонентів у клітинах, статистики оптичної щільності та вимірювання морфології клітин.
