Класифікація та робота мікроскопів для дослідження клітини
Мікроскоп є основним інструментом для спостереження за клітинами. За різними джерелами світла їх можна розділити на дві категорії: оптичні мікроскопи та електронні мікроскопи. Перший використовує видиме світло (УФ-мікроскопи використовують ультрафіолетове світло) як джерело світла, а другий використовує електронні пучки як джерело світла.
-,Оптичний мікроскоп
(1) Звичайний оптичний мікроскоп
Звичайні біологічні мікроскопи складаються з трьох частин, а саме: ① система освітлення, включаючи джерело світла та конденсор; ② система оптичного збільшення, що складається з об’єктива та окуляра, який є основним корпусом мікроскопа. Щоб усунути сферичну та хроматичну аберації, як окуляр, так і об’єктив ③Механічний пристрій, який використовується для фіксації матеріалу та полегшення спостереження (Малюнок 2-1).
Чи чітке зображення мікроскопа визначається не тільки збільшенням, але також пов’язано з роздільною здатністю мікроскопа. Роздільна здатність означає здатність мікроскопа (або людського ока перебувати на відстані 25 см від цілі) розрізняти найменшу відстань між об’єктами. Величина роздільної здатності визначається довжиною хвилі, світлосилою світла і показником заломлення середовища виражаються формулою:
У формулі: n=показник заломлення середовища;=кут апертури (кут розкриття зразка до апертури лінзи об’єктива), NA=апертура лінзи (числова апертура). Кут лінзи завжди менший за 180 градусів, тому максимальне значення sina/2 має бути меншим за 1.
Показник заломлення скла, яке використовується для виготовлення оптичної лінзи, становить від 1,65 до 1,78, а показник заломлення середовища, що використовується, чим ближче до скла, тим краще. Для сухих лінз об’єктива середовищем є повітря, а світлосила лінзи зазвичай становить 0.05 до 0,95; для масляних лінз як середовище використовується кедрова олія, а світлосила лінзи може бути близькою до 1,5.
Довжина хвилі звичайного світла становить {{0}} нм, тому значення роздільної здатності мікроскопа буде не менше 0.2 мкм, а роздільна здатність людського ока становить 0,2 мм, тому максимальне збільшення загальної конструкції мікроскопа зазвичай становить 1000 разів.
(2) Флуоресцентна мікроскопія
Деякі речовини в клітинах, наприклад хлорофіл, можуть флуоресціювати після опромінення ультрафіолетовими променями; деякі речовини самі по собі не можуть флуоресціювати, але якщо їх пофарбувати флуоресцентними барвниками або флуоресцентними антитілами, вони також можуть флуоресцувати під дією ультрафіолетових променів, і флуоресцентний мікроскоп (рис. 2-2, 3, 4) є одним із інструментів для якісного та кількісного дослідження таких речовин.
Флуоресцентні мікроскопи і звичайні мікроскопи мають наступні відмінності:
1. Метод освітлення зазвичай є епі-освітленням, тобто джерело світла проектується на зразок через лінзу об’єктива (рисунок 2-3);
2. Джерелом світла є ультрафіолетове світло, довжина хвилі коротша, а роздільна здатність вища, ніж у звичайних мікроскопів;
3. Існує два спеціальні фільтри: один перед джерелом світла використовується для фільтрації видимого світла, а фільтр між окуляром і лінзою об’єктива використовується для фільтрації ультрафіолетового світла для захисту очей.
(3) Лазерний скануючий конфокальний мікроскоп
Лазерний конфокальний скануючий мікроскоп (лазерний конфокальний скануючий мікроскоп, малюнок 2-5, 6) використовує лазер як скануюче джерело світла та сканує зображення точка за точкою, лінія за лінією, поверхня за поверхнею, а скануючий лазер і колекція флуоресценції мають спільні лінза об’єктива, а фокус лінзи об’єктива Фокус скануючого лазера також є точкою об’єкта миттєвого зображення. Оскільки довжина хвилі лазерного променя коротка, а промінь дуже тонкий, конфокальний лазерний скануючий мікроскоп має вищу роздільну здатність, яка приблизно в 3 рази перевищує роздільну здатність звичайного оптичного мікроскопа. Система фокусується один раз, і сканування обмежується однією площиною зразка. Коли глибина фокусування різна, можна отримати зображення різних рівнів глибини зразка. Ця інформація про зображення зберігається в комп’ютері. Завдяки комп’ютерному аналізу та моделюванню можна відобразити тривимірну структуру зразка клітини.
Конфокальна лазерна скануюча мікроскопія може бути використана не тільки для спостереження морфології клітин, але також для кількісного аналізу внутрішньоклітинних біохімічних компонентів, статистики оптичної щільності та вимірювання морфології клітин.
(4) Темнопольний мікроскоп
Темнопольний мікроскоп (темнопольний мікроскоп, малюнок 2-7) має світловий лист у центрі конденсора, так що світло освітлення не потрапляє безпосередньо в лінзу людини, а лише світло, відбите та дифраговане зразком дозволяється входити в лінзу об'єктива, тому фон поля зору чорний, краї об'єктів світлі. За допомогою цього мікроскопа можна побачити частинки розміром до 4-200 нм, а роздільна здатність може бути в 50 разів вищою, ніж у звичайних мікроскопів.
(5) Фазово-контрастний мікроскоп
Фазово-контрастний мікроскоп (фазово-контрастний мікроскоп, малюнок 2-8, 9) П. Зерніке винайшов у 1932 році та отримав за нього Нобелівську премію з фізики в 1953 році. Найбільшою особливістю цього мікроскопа є те, що він може спостерігати за незабарвленими зразками та живими клітинами.
Основним принципом фазово-контрастної мікроскопії є зміна оптичної різниці ходу видимого світла, що проходить через зразок, на різницю амплітуд, тим самим покращуючи контраст між різними структурами та роблячи різні структури чітко видимими. Після проходження через зразок світло заломлюється, відхиляється від початкового оптичного шляху та затримується на 1/4λ (довжини хвилі). Посилити, збільшити або зменшити амплітуду, збільшити контраст. З точки зору структури, фазово-контрастні мікроскопи мають дві особливості, які відрізняються від звичайних оптичних мікроскопів:
1. Кільцева діафрагма розташована між джерелом світла та конденсором, і її функція полягає в тому, щоб світло, що проходить через конденсор, утворювало порожнистий світловий конус і фокусувалося на зразку.
2. Фазова пластина (кільцеподібна фазова пластина) додає фазову пластину, покриту фторидом магнію в лінзі об’єктива, яка може затримувати фазу прямого або дифрагованого світла на 1/4λ. Існує два види:
①Плюс фазової пластини: пряме світло затримується на 1/4λ. Після об’єднання двох груп світлових хвиль світлові хвилі додаються разом і амплітуда збільшується. Структура зразка яскравіша за навколишнє середовище, утворюючи яскравий контраст (або негативний контраст).
② B плюс фазова пластина: дифракційне світло затримується на 1/4λ. Після об’єднання двох наборів променів світлові хвилі віднімаються, і амплітуда стає меншою, утворюючи темний контраст (або позитивний контраст), а структура темніша за навколишнє середовище.
