Застосування концепції сучасного мікроскопа в спостереженні за мікроскопічним світом
З давніх часів і до сьогодення люди шукали вищих і далеких істин. Від океанських подорожей до дослідження космосу люди одна за одною досягали великих цілей. Однак макроскопічний світ, який люди бачать неозброєним оком, не є цілим світом, і людське око не може його чітко побачити. Це також приваблює незліченну кількість людей, щоб досліджувати та шукати.
Незалежно від макроскопічних чи мікроскопічних речей, наші спостереження базуються на атрибутах тривимірного простору, тобто тривимірності XYZ, і спостереження змін у формі речей потребує введення іншого фактора вимірювання - часу T, тому Найповнішим способом спостереження має бути одночасний запис XYZT, тобто тривале фотографування форми плюс час, також є основною функцією мікроскопа.
Після більш ніж 300 років розвитку сучасні мікроскопи запропонували такі поняття, як роздільна здатність, глибина різкості та поле зору, і постійно пропонували рішення. Спочатку мікроскопи задовольняли наші потреби в спостереженні за мікроскопічним світом і допомагали нам записувати простір і час мікросвіту.
Найважливіша річ у мікроскопічному спостереженні за світом — це роздільна здатність деталей, і звідси народилася концепція роздільної здатності. Роздільна здатність означає мінімальну відстань між двома точками, яку може розрізнити людське око, і дійсна лише у вимірі XY. Відповідно до критерію Релея, межа, яку можуть розрізнити звичайні люди, становить дві точки 0,2 мм на відстані 25 см. Коли ми використовуємо мікроскоп, ми можемо бачити дві точки на меншій відстані, що покращує роздільну здатність нашого спостереження. З постійним поглибленням сучасних досліджень вимоги людей до роздільної здатності також постійно зростають, і вчені також постійно вдосконалюють роздільну здатність мікроскопів. Наприклад, електронні мікроскопи збільшили роздільну здатність до нанометрового рівня, що дозволяє спостерігати за вірусами. Технологія ультрависокої мікроскопічної візуалізації покращує роздільну здатність мікроскопа з 200 нанометрів до десятків нанометрів, реалізуючи спостереження органел живої клітини.
Поліпшення роздільної здатності також приносить нові проблеми, тобто зменшення поля зору та глибини різкості. У разі використання звичайного методу центрального освітлення (метод фотопічного освітлення, який змушує світло рівномірно проходити через зразок), роздільна відстань мікроскопа становить d=0,61 λ/NA, діапазон довжин хвиль видимого світла становить { {2}} нм, середня довжина хвилі становить 550 нм, а довжина хвилі є фіксованою константою. Таким чином, збільшення значення NA може отримати менше значення D, тобто відстань між двома точками, які можна розрізнити Менше, що дозволяє людям чітко бачити менші об’єкти.
Значення NA – це числова апертура, яка описує розмір кута світлоприймального конуса лінзи, NA=n * sin , тобто добуток показника заломлення (n) середовища між лінзою та об’єкт огляду та синус половини апертурного кута (2 ). n – показник заломлення світла середовища між об’єктивом і зразком. Коли космічним середовищем об’єкта мікроскопа є повітря, показник заломлення n=1. Використання середовища з вищим показником заломлення, ніж повітря, може значно збільшити значення NA. Середовищем занурення у воду є дистильована вода, а коефіцієнт заломлення становить 1,33; масляним імерсійним об'єктивом є кедрова олія або інші прозорі олії, і його показник заломлення зазвичай становить близько 1,52, що близько до показника заломлення лінзи та предметного скла. Тому значення NA масляної лінзи вище, ніж у повітряної лінзи.
Кут апертури, також відомий як «кут отвору дзеркала», — це кут, утворений точкою предмета на оптичній осі лінзи та ефективним діаметром передньої лінзи лінзи об’єктива. Збільшення кута рота дзеркала може збільшити значення синуса, і його фактична верхня межа становить приблизно 72 градуси (значення синуса 0.95), помножене на показник заломлення кедрової олії 1,52, можна отримати, що максимальне значення NA становить близько 1,45, і підставляючи його у формулу розрахунку роздільної здатності, можна отримати, що гранична роздільна здатність у площині XY звичайного мікроскопа становить приблизно 0.2um.
Значення NA також безпосередньо впливає на яскравість поля зору мікроскопа (B). З формули B∝NA2/M2 можна зробити висновок, що яскравість збільшується зі збільшенням числової апертури (NA) або зменшенням збільшення лінзи об’єктива (M).
Теоретично, ми повинні прагнути до найвищого можливого значення NA, щоб отримати кращу роздільну здатність площини XY і яскравість поля зору. Проте все має дві сторони. Покращення роздільної здатності площини XY зменшить глибину різкості осі Z і поле огляду.
Мікроскопи зазвичай дивляться вертикально вниз. Коли опукле та увігнуте положення на поверхні об’єкта, що спостерігається в межах діаметра поля зору, можна чітко побачити, тоді різниця у висоті між опуклою точкою та увігнутою точкою є глибиною різкості. Для мікроскопів чим більше глибина різкості, тим краще. Чим більша глибина різкості, тим кращі та більш чіткі тривимірні зображення можна отримати під час спостереження за поверхнею нерівних об’єктів. Велика глибина різкості допомагає нам спостерігати мікроскопічний світ у вертикальному напрямку. Тобто інформація по осі Z у тривимірній формі XYZ.
Глибина різкості – це глибина переднього та заднього простору, що відповідає чіткому зображенню на площині зображення: dtot=(λ*n)/NA плюс n/(M∗NA) * e, dtot: глибина різкості , NA: числова апертура, M: загальне збільшення, λ: довжина хвилі світла (зазвичай λ=0.55um), n: показник заломлення середовища між зразком і лінзою об’єктива (повітря: n{{3 }}, масло: n=1.52) Відповідно до цієї формули ми можемо знати, що глибина різкості осі Z обернено пропорційна значенню NA площини XY.
Окрім глибини різкості, на поле зору також впливає значення NA. Просторовий діапазон, який можна побачити, коли інструмент нерухомо дивиться на точку, є полем зору. Його розрахунок безпосередньо пов'язаний зі збільшенням лінзи об'єктива. Фактичний діаметр поля зору, видимого під час спостереження, дорівнює діаметру поля зору, поділеному на збільшення лінзи об’єктива, окуляр покаже відповідне поле зору, наприклад 10/18, тобто збільшення в 10 разів, а діаметр поля зору - 18 мм. Тому, коли визначається окуляр, чим більше збільшення, тим менше спостережуване поле зору.
Роздільна здатність площини XY є аналізом локальних деталей, а поле зору визначає наш діапазон спостереження зразка. Чим більше поле зору, тим краще, але обмежені поточною технологією, ми повинні використовувати об’єктиви високої потужності, щоб отримати хороші значення NA, отже, поле зору та значення NA мають непряму негативну кореляцію.
