Застосування флуоресцентної флуоресцентної мікроскопії повного внутрішнього відбиття
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), флуоресцентний мікроскоп із повним внутрішнім відображенням, коли світло потрапляє в середовище з нижчим показником заломлення із середовища з високим показником заломлення, якщо кут падіння достатньо великий, все світло відбивається без заломлення, але на межі розділу двох середовищ виробляються миттєві хвилі, які можуть збуджувати флуоресценцію в межах 100 нм поблизу межі розділу, щоб реалізувати спостереження поверхні об’єкта. Світло збудження може проходити через освітлювач звичайного флуоресцентного мікроскопа або через спеціальний освітлювач, і можна контролювати кут падіння лазера. Метод миттєвого збудження поля використовується для запобігання потраплянню світла збудження в детектор. Збуджувальне світло на межі розділу між склом і водою створює повне внутрішнє освітлення, реалізоване відбиттям. Завдяки експоненціальному ослабленню збуджуючого світла лише область зразка, дуже близька до повної поверхні відбиття, вироблятиме флуоресцентне відображення, що значно зменшує перешкоди шуму фонового світла об’єкту спостереження, тому ця технологія широко використовується в динамічному спостереженні. речовин клітинної поверхні.
Принципова схема флуоресцентної мікроскопії повного внутрішнього відбиття (TIRFM)
①Зразок ②Діапазон загасаючих хвиль ③Покривне скло ④Олійне занурення ⑤Мішень ⑥Промінь випромінювання (сигнал) ⑦Промінь збудження
Щоб досягти повного внутрішнього відбиття, потрібен великий кут падіння, наприклад, кут падіння на межі скло-вода перевищує 61 градус. Цього можна досягти за допомогою призми, яка називається TIRFM на основі призми, або об’єктива з високою числовою апертурою, яка називається TIRFM об’єктивного типу. Сучасні комерційні флуоресцентні мікроскопи повного внутрішнього відображення, як правило, мають об’єктивний тип, мають високу швидкість і високу точність.
Флуоресцентна мікроскопія з повним внутрішнім відображенням широко використовується в деяких галузях біології, оскільки вона може здійснювати спостереження флуоресценції в дуже тонкому діапазоні (менше 100 нм) на поверхні об’єктів. Наприклад, такі програми:
Спостереження зображень клітинної поверхні: структура поверхні клітинної мембрани, контакт поверхні клітини, динаміка поверхні мембрани/локалізація білка.
Спостереження та маніпуляції окремою молекулою: міозин, актин і Cy3-мічений АТФ.
Рух поверхні клітинної мембрани: наприклад, поглинання везикул, видих везикул і екзокринна секреція везикул. в
Спостереження за феноменом утворення кальцію в клітинній мембрані, моніторинг іонних каналів.
Дослідження молекулярної моторики: обертальні двигуни, цитоскелетні білки, полімери, G-білки, кільцеві білки, нуклеотидні двигуни.
На додаток до галузі біології, він також має хороші застосування в галузі хімії для спостереження за хімічними молекулярними структурами.
