Спостереження флуоресценції за допомогою оптичного мікроскопа
Флуоресценція означає процес, у якому флуоресцентна речовина майже одночасно випромінює світло з більшою довжиною хвилі, коли вона опромінюється світлом певної довжини хвилі (рис. 1). Коли світло певної довжини хвилі (довжина хвилі збудження) потрапляє на молекулу, наприклад у флуорофор, енергія фотона поглинається електронами молекули. Далі електрони переходять з основного стану (S0) на вищий енергетичний рівень, збуджений стан (S1'). Цей процес називається збудженням①. Електрон залишається у збудженому стані протягом 10-9–10-8 секунд, протягом яких електрон втрачає частину енергії②. Під час процесу виходу електронів зі збудженого стану (S1) і повернення в основний стан③ решта енергії, поглиненої під час процесу збудження, вивільняється.
Флуоресцентна діаграма Яблонського
Час перебування флуоресцентної молекули у збудженому стані – це час життя флуоресценції, який зазвичай становить наносекундний рівень і є невід’ємною характеристикою самої флуоресцентної молекули. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), який використовує технологію візуалізації флуоресценції протягом усього життя, може виконувати більш глибокі функціональні вимірювання на додаток до зображення інтенсивності флуоресценції та отримати молекулярну конформацію, міжмолекулярні взаємодії та мікрооточення молекул тощо. Інформація, яку важко отримати отримати за допомогою звичайного оптичного зображення.
Іншою важливою властивістю флуоресценції є Стоксів зсув, різниця довжин хвиль між піками збудження та випромінювання (рис. 2). Зазвичай довжина хвилі випромінювання більша за довжину хвилі збудження. Це пов’язано з тим, що електрони втратять частину своєї енергії через процес релаксації після того, як флуоресцентна речовина збудиться і перед тим, як випустять фотони. Флуоресцентні речовини з більшим стоксовим зсувом легше спостерігати під флуоресцентним мікроскопом.
флуоресцентний мікроскоп
Флуоресцентний мікроскоп — це оптичний мікроскоп, який використовує властивості флуоресценції для спостереження та отримання зображень і широко використовується в різних галузях, таких як клітинна біологія, нейробіологія, ботаніка, мікробіологія, патологія та генетика. Флуоресцентне зображення має такі переваги, як висока чутливість і висока специфічність, і дуже підходить для спостереження за розподілом специфічних білків і органоїдів у тканинах і клітинах, вивчення спільної локалізації та взаємодії, відстеження життєвих динамічних процесів, таких як зміни концентрації іонів. і т.д.
Більшість молекул у клітинах не флуоресціюють, і якщо ви хочете їх побачити, ви позначаєте їх флуоресцентними. Існує багато методів флуоресцентного мічення, таких як пряме мічення (наприклад, використання DAPI для мічення ДНК), імунне фарбування з використанням антигензв’язуючих властивостей антитіл або використання флуоресцентних білків (таких як GFP, зелений флуоресцентний білок) для мічення цільових білків , і оборотне зв'язування. синтетичні барвники (такі як Fura-2) тощо.
Інвертований флуоресцентний мікроскоп MF53-N
В даний час флуоресцентний мікроскоп став стандартним обладнанням для обробки зображень у різних лабораторіях і платформах для обробки зображень і є хорошим помічником у наших щоденних експериментах. Флуоресцентні мікроскопи в основному поділяються на три категорії: вертикальні флуоресцентні мікроскопи (придатні для розрізів), інвертовані флуоресцентні мікроскопи (підходять для живих клітин, враховуючи розрізи), флуоресцентні стереоскопи (підходять для більших зразків, таких як рослини, рибки даніо (дорослі/ембріони). ), медака, органи миші/щура тощо).
Технологія отримання зображень флуоресцентної мікроскопії широко використовується та має багато видів, а нові технології все ще з’являються. Ви можете вибрати технологію для завершення власного дослідження.
