Навіщо потрібна конфокальна мікроскопія?
1. Після зусиль і вдосконалень наших великих попередників оптичний мікроскоп досяг ідеального рівня. Фактично, звичайні мікроскопи можуть просто та швидко надати нам чудові мікроскопічні зображення. Однак сталася подія, яка принесла революційну інновацію в цей майже ідеальний світ мікроскопів, а саме винахід «лазерного скануючого конфокального мікроскопа». Особливістю цього нового типу мікроскопа є те, що в ньому використовується оптична система, яка лише витягує інформацію про зображення на поверхні, де зосереджено фокус. Змінюючи фокус і відновлюючи отриману інформацію в пам'яті зображень, він може отримувати яскраві зображення з повним тривимірним інформаційним інтелектом. За допомогою цього методу можна легко отримати інформацію про форму поверхні, яку неможливо підтвердити звичайними мікроскопами. Крім того, для типових оптичних мікроскопів «підвищення роздільної здатності» і «поглиблення фокусної глибини» є суперечливими умовами, особливо при великому збільшенні. Однак у конфокальних мікроскопах ця проблема легко вирішується.
2. Переваги конфокальних оптичних систем
Конфокальна оптична система використовується для точкового освітлення зразка, а відбите світло також приймається точковим датчиком. Коли зразок знаходиться у фокусі, майже все відбите світло може досягати датчика. Коли зразок відхиляється від фокусної точки, відбите світло не може досягти датчика. Тобто в конфокальній оптичній системі буде виведено лише зображення, яке збігається з фокусом, а пляма та непотрібне розсіяне світло будуть екрановані.
Навіщо використовувати лазер?
У конфокальних оптичних системах точкове освітлення прикладається до зразка, і відбите світло також приймається точковим датчиком. Тому точкові джерела світла стали необхідними. Лазер є дуже точковим джерелом світла. У більшості випадків джерелом світла конфокальної мікроскопії є лазер. Крім того, монохроматичність, спрямованість і відмінна форма променя лазерів також є важливими причинами їх широкого застосування.
4. Стає можливим спостереження в реальному часі на основі високошвидкісного сканування
Лазерне сканування використовує акустичний оптичний рефлектор (AO) у горизонтальному напрямку та дзеркало Servo Galvano у вертикальному напрямку. Завдяки відсутності механічних коливань в аудіооптичному блоці зміщення можна виконувати високошвидкісне сканування та спостерігати в режимі реального часу на екрані моніторингу. Висока швидкість камер цього типу є дуже важливим фактором, який безпосередньо впливає на швидкість фокусування та визначення положення.
5. Зв’язок між положенням фокусу та яскравістю
У конфокальній оптичній системі, коли зразок правильно розміщений у фокусному положенні, яскравість висока, а яскравість різко зменшується перед і після нього (суцільна лінія на малюнку 4). Чутлива селективність цієї фокальної площини є саме принципом, що лежить в основі визначення напрямку висоти та розширення глибини фокусу в конфокальній мікроскопії. Порівняно з цим, типові оптичні мікроскопи не демонструють значних змін яскравості до та після положення фокусу (пунктирна лінія на малюнку 4).
6. Висока контрастність і роздільна здатність
Типовий оптичний мікроскоп через перешкоди, викликані відбитим світлом, що відхиляється від фокусної точки, перекривається з фокальною частиною зображення, що призводить до зменшення контрастності зображення. Навпаки, у конфокальних оптичних системах розсіяне світло поза фокусом і розсіяне світло всередині лінзи об’єктива майже повністю видаляються, таким чином отримуючи зображення з дуже високим контрастом. Крім того, завдяки тому, що світло проходить через лінзу об'єктива двічі, точкове зображення спочатку стає різкішим, що також покращує роздільну здатність мікроскопа.
