Чому мені потрібен конфокальний мікроскоп?
1. Оптичний мікроскоп був удосконалений завдяки зусиллям і вдосконаленням наших великих попередників. Фактично, звичайний мікроскоп може легко і швидко надати нам гарні мікроскопічні зображення. Проте подією, яка зробила революцію у світі майже ідеальних мікроскопів, став винахід «лазерного скануючого конфокального мікроскопа». Цей новий тип мікроскопа характеризується оптичною системою, яка витягує інформацію про зображення лише з поверхні, на якій зосереджено фокус, і, змінюючи фокус під час відновлення отриманої інформації в пам’яті зображень, можна отримати чітке зображення з повна 3-розмірна інформація. Таким чином можна легко отримати інформацію про форму поверхні, яку неможливо підтвердити за допомогою звичайного мікроскопа. Крім того, хоча «підвищення роздільної здатності» та «поглиблення глибини фокусу» є суперечливими умовами для звичайних оптичних мікроскопів, особливо при великому збільшенні, цю проблему вирішують за допомогою конфокальних мікроскопів.
2. Переваги конфокальної оптичної системи
Принципова схема лазерного конфокального мікроскопа
Конфокальна оптична система є точковим освітленням зразка, тоді як відбите світло також приймається за допомогою точкового рецептора. Коли зразок поміщається в фокусну точку, майже все відбите світло досягає фоторецептора, а коли зразок знаходиться поза фокусом, відбите світло не може досягти фоторецептора. Іншими словами, у конфокальній оптичній системі виводиться лише зображення, яке збігається з фокальною точкою, а плями та непотрібне розсіяне світло блокуються.
3. Для чого використовують лазер?
У конфокальній оптичній системі зразок освітлюється в точці, а відбите світло приймає точковий датчик. Тому потрібне точкове джерело світла. Лазери є в основному точковим джерелом світла. У більшості випадків джерелом світла для конфокальних мікроскопів є лазерне джерело світла. Крім того, монохроматичність, спрямованість і чудова форма променя лазерів є важливими причинами їх широкого застосування.
4. Можливе спостереження в режимі реального часу на основі високошвидкісного сканування.
Для лазерного сканування в горизонтальному напрямку використовується блок акустичного оптичного відхилення (Acoustic Optical Deflector, AO prime), а в вертикальному – дзеркало сканування променя з сервоелектронним керуванням (Servo Galvano-mirror). Оскільки в AO Deflector відсутня механічна вібрація, можливе високошвидкісне сканування та можливе спостереження на екрані монітора в реальному часі. Висока швидкість цієї камери є дуже важливим пунктом, який безпосередньо впливає на швидкість фокусування та визначення положення.
5. Зв’язок між положенням фокуса та яскравістю
У конфокальній оптичній системі зразок правильно розміщується у фокусному положенні, коли яскравість zui велика, перед і позаду нього його яскравість буде різко зменшена (малюнок 4, суцільна лінія). Ця чутлива вибірковість фокальної площини є принципом орієнтації конфокального мікроскопа по висоті та глибини розширення фокусу. Навпаки, звичайні оптичні мікроскопи не показують жодних суттєвих змін яскравості до та після положення фокусу (пунктирна лінія на рис. 4).
6. Високий контраст, висока роздільна здатність
У звичайному оптичному мікроскопі світло, відбите від нефокусної частини мікроскопа, заважає фокальній частині мікроскопа та накладається на неї, що призводить до зменшення контрастності зображення. Навпаки, у конфокальній оптичній системі розсіяне світло поза фокальною точкою та всередині лінзи об’єктива майже повністю видаляється, що призводить до зображення з дуже високим контрастом. Крім того, покращується роздільна здатність мікроскопа, оскільки світло двічі проходить крізь лінзу об’єктива, загострюючи точкове зображення.
7. Функція оптичної локалізації
У конфокальній оптичній системі відбите світло екранується мікроапертурою в точці, відмінній від точки фокусу. У результаті при спостереженні за тривимірним зразком формується зображення, наче зразок розрізано фокусною точкою (рис. 5). Цей ефект називається оптичною локалізацією і є однією з особливостей конфокальних оптичних систем.
