Яке призначення конфокального мікроскопа?
1. Після зусиль і вдосконалень наших великих попередників оптичний мікроскоп досяг точки досконалості. Насправді звичайні мікроскопи можуть просто й швидко надати нам чудові мікроскопічні зображення. Однак сталася подія, яка принесла революційну інновацію в цей майже ідеальний світ мікроскопів, а саме винахід «лазерного скануючого конфокального мікроскопа». Особливістю цього нового типу мікроскопа є те, що в ньому використовується оптична система, яка лише витягує інформацію про зображення на поверхні, де зосереджено фокус, і відновлює отриману інформацію в пам’яті зображень під час зміни фокусу, щоб можна було отримати повну 3D-інформацію. отримано. Яскравий образ інтелекту. За допомогою цього методу можна легко отримати інформацію про форму поверхні, яку неможливо підтвердити за допомогою звичайного мікроскопа. Крім того, для звичайних оптичних мікроскопів «підвищення роздільної здатності» і «поглиблення глибини фокусу» є суперечливими умовами, особливо при великих збільшеннях ця суперечність є більш помітною, але з точки зору конфокальних мікроскопів цю проблему легко вирішити.
2. Переваги конфокальної оптичної системи
Принципова схема лазерного конфокального мікроскопа
Конфокальна оптична система виконує точкове освітлення зразка, і відбите світло також сприймається точковим рецептором. Коли зразок знаходиться у фокусі, майже все відбите світло може досягти фоторецептора, а коли зразок знаходиться поза фокусом, відбите світло не може досягти фоторецептора. Тобто в конфокальній оптичній системі буде виведено лише зображення, яке збігається з фокальною точкою, а світлові плями та непотрібне розсіяне світло будуть екрановані.
3. Навіщо використовувати лазер?
У конфокальній оптичній системі зразок освітлюється в точці, і відбите світло також приймається точковим фоторецептором. Тому точкове джерело світла стає необхідним. Лазери є дуже точковими джерелами світла. У більшості випадків лазерні джерела світла використовуються як джерела світла для конфокальних мікроскопів. Крім того, характеристики монохроматичності, спрямованості та чудової форми променя лазера також є важливими причинами його широкого застосування.
4. Стає можливим спостереження в режимі реального часу на основі високошвидкісного сканування
Для лазерного сканування в горизонтальному напрямку використовується блок оптичного відхилення з акустичним керуванням (Acoustic Optical Deflector, AO element), а у вертикальному – Servo Galvano-дзеркало. Оскільки акустооптичний блок відхилення не має механічної вібраційної частини, він може виконувати високошвидкісне сканування та можливе спостереження на екрані монітора в реальному часі. Ця висока швидкість отримання зображень є дуже важливим елементом, який безпосередньо впливає на швидкість фокусування та визначення положення.
5. Зв’язок між положенням фокуса та яскравістю
У конфокальній оптичній системі яскравість зразка є максимальною, коли зразок правильно розміщений у фокусному положенні, і його яскравість різко зменшується перед і після нього (суцільна лінія на малюнку 4). Чутлива селективність фокальної площини також є принципом визначення висоти конфокального мікроскопа та розширення фокусної глибини. Навпаки, звичайні оптичні мікроскопи не мають значних змін яскравості до і після положення фокуса.
6. Висока контрастність, висока роздільна здатність
У звичайних оптичних мікроскопах через інтерференцію відбитого світла від фокусної частини воно накладається на фокусну частину зображення, що призводить до зменшення контрастності зображення. З іншого боку, у конфокальній оптичній системі розсіяне світло поза фокальною точкою та розсіяне світло всередині лінзи об’єктива майже повністю видаляються, тому можна отримати зображення з дуже високим контрастом. Крім того, оскільки світло проходить через лінзу об’єктива двічі, точкове зображення спочатку стає різкішим, що також покращує роздільну здатність мікроскопа.
7. Функція оптичної локалізації
У конфокальній оптичній системі відбите світло, відмінне від точки, що збігається з фокальною точкою, екранується мікропорою. Тому при спостереженні за тривимірним зразком формується зображення, наче зразок розрізаний фокальною площиною (рис. 5). Цей ефект відомий як оптична локалізація і є однією з особливостей конфокальних оптичних систем.
8. Функція мобільної пам'яті Focus
Так зване відбите світло за межами фокальної точки екранується мікропорами. З іншого боку, можна вважати, що всі точки на зображенні, сформованому конфокальною оптичною системою, збігаються з фокальною точкою. Отже, якщо тривимірний зразок переміщати вздовж осі Z (оптичної осі), зображення накопичуються і зберігаються в пам’яті, і врешті-решт буде отримано зображення, сформоване всім зразком і фокусною точкою. Функція нескінченного поглиблення глибини фокусу таким чином називається функцією мобільної пам'яті.
9. Функція вимірювання форми поверхні
З точки зору функції зміщення фокусу, форму поверхні зразка можна виміряти безконтактним способом, додавши схему запису висоти поверхні. На основі цієї функції можна записати координати осі Z, утворені максимальним значенням яскравості в кожному пікселі, і на основі цієї інформації можна отримати інформацію, пов’язану з формою поверхні зразка.
10. Високоточна функція вимірювання мікророзміру
Світлоприймальний блок використовує 1-розмірний ПЗЗ-датчик зображення, тому на нього не впливає нахил скануючого пристрою скануючого пристрою, що дозволяє виконувати високоточні вимірювання. Крім того, завдяки використанню функції пам'яті зміщення фокусу з регульованою глибиною фокусування (поглибленням) можна усунути помилку вимірювання, спричинену зміщенням фокусу.
11. Аналіз тривимірного зображення
Використовуючи функцію вимірювання форми поверхні, ви можете легко створити тривимірне зображення поверхні зразка. Не тільки це, але також може виконувати різноманітні аналізи, такі як: вимірювання шорсткості поверхні, площі, об’єму, площі поверхні, круглості, радіуса, максимальної довжини, периметра, центру ваги, томографічного зображення, трансформації ШПФ, вимірювання ширини лінії тощо .
Лазерний конфокальний скануючий мікроскоп можна використовувати не тільки для спостереження морфології клітин, але й для кількісного аналізу внутрішньоклітинних біохімічних компонентів, статистики оптичної щільності та вимірювання морфології клітин.
