Двофотонна флуоресцентна мікроскопія має багато переваг:
1) Світло з більшою довжиною хвилі менше піддається розсіюванню, ніж світло з коротшою довжиною хвилі для проникнення в зразок;
(2) Флуоресцентні молекули за межами фокальної площини не збуджуються, щоб більше збуджувального світла могло досягати фокальної площини, щоб збуджувальне світло могло проникати глибше в зразок;
3) Довші довжини хвилі ближнього інфрачервоного світла менш токсичні для клітин, ніж коротші хвилі;
4) При використанні двофотонного мікроскопа для спостереження за зразком фотознебарвлення та фототоксичність присутні лише у фокальній площині. Таким чином, двофотонні мікроскопи більш підходять, ніж однофотонні мікроскопи, для спостереження за товстими зразками, для спостереження за живими клітинами або для проведення експериментів з точковим фотовідбілюванням.
Знання конфокального флуоресцентного мікроскопа
Основний принцип конфокального флуоресцентного мікроскопа: точкове джерело світла використовується для опромінення зразка, утворюючи невелику, чітко визначену точку світла на фокальній площині. Флуоресценція, що випромінюється з цієї точки після опромінення, збирається лінзою об’єктива та повертається до світлорозділювача, що складається з двонаправленого хроматичного дзеркала вздовж вихідного шляху світла випромінювання. Розділювач променя направляє флуоресценцію безпосередньо на детектор. Як джерело світла, так і детектор мають отвір перед собою, який називається отвором освітлення та отвором виявлення відповідно. Обидві мають однакову геометрію, приблизно 100-200 нм, і спряжені щодо точки світла на фокальній площині, тобто точка світла проходить через низку лінз і в кінцевому підсумку може бути сфокусована на обох освітлювальних і отвори детектора. Таким чином, світло з фокальної площини може сходитися всередині отвору зонда, тоді як розсіяне світло згори або під фокальною площиною блокується за межами апертури зонда, і його неможливо відобразити. Лазер сканує зразок точка за точкою, а фотопомножувач після виявлення отвору також отримує конфокальне зображення відповідної світлової точки точка за точкою, яке перетворюється на цифровий сигнал і передається на комп’ютер, і, нарешті, збирається в чітке зображення. конфокальне зображення всієї фокальної площини на екрані.
Кожне зображення у фокальній площині насправді є оптичним перерізом зразка, і цей оптичний переріз завжди має певну товщину, також відомий як оптичний лист. Оскільки інтенсивність світла в фокальній точці набагато більша, ніж у нефокальній точці, а світло нефокальної площини відфільтровується отвором, глибина різкості конфокальної системи наближається до нуля, а сканування вздовж напрямку осі Z дозволяє оптичній томографії сформувати двовимірний оптичний зріз зразка для спостереження у фокальній плямі. Поєднуючи сканування площини XY (фокальної площини) зі скануванням осі Z (оптичної осі), можна отримати тривимірне зображення зразка шляхом накопичення послідовних шарів двовимірних зображень, які обробляються спеціальним комп’ютерним програмним забезпеченням.
Це означає, що отвір виявлення та отвір джерела світла завжди сфокусовані в одній точці, тому флуоресценція, що збуджується поза фокальною площиною, не може потрапити в отвір виявлення.
Принцип роботи конфокального лазера просто виражається в тому, що він використовує лазер як джерело світла на основі традиційного флуоресцентного мікроскопічного зображення, додаткового лазерного скануючого пристрою та сполученого фокусуючого пристрою за допомогою комп’ютерного керування для отримання цифрових зображень і системи обробки.
