Принцип, характеристики та застосування флуоресцентного мікроскопа
Принцип і структурні характеристики флуоресцентного мікроскопа: флуоресцентний мікроскоп використовує точкове джерело світла з високою ефективністю світла для випромінювання певної довжини хвилі світла (наприклад, ультрафіолетове світло 3650 дюймів або фіолетове синє світло 4200 дюймів) через систему фільтрів як збудження. світло, щоб стимулювати флуоресценцію в зразку. Після того, як речовина випромінює флуоресценцію різних кольорів, її спостерігають за допомогою збільшення лінзи об’єктива та окуляра. Таким чином, під сильним контрастним фоном, навіть якщо флуоресценція дуже слабка, його легко ідентифікувати та він має високу чутливість. В основному він використовується для дослідження структури та функції клітини та хімічного складу. Основна структура флуоресцентного мікроскопа складається зі звичайного оптичного мікроскопа та деяких аксесуарів (таких як флуоресцентне джерело світла, фільтр збудження, двоколірний світлорозділювач і блокуючий фільтр тощо). Флуоресцентне джерело світла — зазвичай використовують ртутну лампу надвисокого тиску (50-200 Вт), яка може випромінювати світло з різною довжиною хвилі, але кожна флуоресцентна речовина має довжину хвилі збудження, яка створює найсильнішу флуоресценцію, тому фільтр збудження (загалом, існують ультрафіолетові, фіолетові, сині та зелені фільтри збудження), які пропускають світло збудження лише певної довжини хвилі та опромінюють зразок, поглинаючи інше світло. Після того, як кожна речовина опромінюється збуджуючим світлом, вона випромінює видиму флуоресценцію з довшою довжиною хвилі, ніж довжина хвилі опромінення, за дуже короткий час. Флуоресценція є специфічною і зазвичай слабшою, ніж світло збудження. Для спостереження специфічної флуоресценції необхідний блокуючий (або пригнічуючий) фільтр за лінзою об’єктива.
Він виконує дві функції: одна полягає в поглинанні та блокуванні збуджувального світла від потрапляння в окуляр, щоб не порушити флуоресценцію та не пошкодити очі; інший – вибрати та пропустити певну флуоресценцію, показуючи певний флуоресцентний колір. Два фільтри необхідно використовувати разом.
Існує два типи флуоресцентних мікроскопів за оптичним шляхом:
1. Просвічуючий флуоресцентний мікроскоп: джерело збуджуючого світла пропускають через матеріал зразка через конденсорну лінзу для збудження флуоресценції. Зазвичай використовується колектор темного поля, і звичайний колектор також можна використовувати для налаштування дзеркала таким чином, щоб збуджувальне світло перенаправлялося в обхід зразка. Це старіший флуоресцентний мікроскоп. Перевагою є те, що флуоресценція є сильною при малому збільшенні, але недоліком є те, що флуоресценція зменшується зі збільшенням збільшення. Тому краще спостерігати за більшими матеріалами зразків.
2. Епіфлуоресцентний мікроскоп - це новий тип флуоресцентного мікроскопа, розроблений у наш час. Різниця полягає в тому, що збуджуюче світло падає від лінзи об’єктива до поверхні зразка, тобто одна і та ж лінза об’єктива використовується як освітлювальний конденсор і лінза об’єктива для збору флуоресценції. Дихроїчний дільник променя потрібно додати на шляху світла, який знаходиться на 45 градусів від легкого урану. Світло збудження відбивається в лінзі об'єктива і збирається на зразку. Флуоресценція, що генерується зразком, і світло збудження, відбите поверхнею лінзи об’єктива та поверхнею покривного скла, надходять в лінзу об’єктива одночасно та повертаються до двоколірного розсіювача променя, щоб зробити світло збудження відокремленим від флуоресценції. , залишкове світло збудження поглинається блокуючими фільтрами. Наприклад, зміна на комбінацію різних фільтрів збудження/двоколірного світлорозділювача/блокувального фільтра може задовольнити потреби різних флуоресцентних продуктів реакції. Перевага цього типу флуоресцентного мікроскопа полягає в тому, що освітлення поля зору рівномірне, зображення чітке, і чим більше збільшення, тим сильніше флуоресценція.
Як користуватися флуоресцентним мікроскопом
1. Увімкніть джерело світла, і ртутна лампа надвисокого тиску повинна прогрітися протягом кількох хвилин, щоб досягти найяскравішої точки.
2. На трансмісійному флуоресцентному мікроскопі необхідно встановити необхідний фільтр збудження між джерелом світла та конденсором, а також встановити відповідний блокуючий фільтр за лінзою об’єктива. Епіфлуоресцентні мікроскопи повинні вставляти необхідні фільтри збудження/двоколірний світлорозділювач/блокувальні фільтри в слоти на оптичному шляху.
3. Спостерігайте за допомогою об’єктива з малим збільшенням і відрегулюйте центр джерела світла так, щоб він знаходився в центрі всієї плями освітлення відповідно до пристрою налаштування різних моделей флуоресцентних мікроскопів.
4. Помістіть зразок і спостерігайте після фокусування. Слід звернути увагу під час використання: не дивіться безпосередньо кінцевим фільтром, щоб не пошкодити очі; при спостереженні зразків за допомогою масляної лінзи необхідно використовувати спеціальну масляну лінзу без флуоресценції; після вимкнення ртутної лампи високого тиску її не можна відразу ввімкнути знову, її необхідно перевірити. Його можна перезапустити через 5 хвилин, інакше він буде нестабільним і вплине на термін служби ртутної лампи.
