Основним методом спостереження за допомогою оптичного мікроскопа є флуоресцентне спостереження
Явище флуоресценції
Флуоресценція означає процес, у якому флуоресцентна речовина майже одночасно випромінює світло з більшою довжиною хвилі, коли її опромінюють світлом певної довжини хвилі (рис. 1). Коли світло певної довжини хвилі (довжина хвилі збудження) потрапляє на молекулу (наприклад, молекулу у флуорофорі), енергія фотона поглинається електронами молекули. Далі електрони переходять з основного стану (S0) на вищий енергетичний рівень, збуджений стан (S1'). Цей процес називається збудженням①. Електрон залишається у збудженому стані протягом 10-9–10-8 секунд, протягом яких електрон втрачає частину енергії ②. У процесі виходу зі збудженого стану (S1) і повернення до основного стану ③ енергія, що залишилася, поглинена під час процесу збудження, буде вивільнена.
Час перебування флуоресцентної молекули у збудженому стані — це час життя флуоресценції, як правило, у наносекундах, що є властивою характеристикою самої флуоресцентної молекули. Технологія візуалізації з використанням часу життя флуоресценції називається Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), яка може виконувати більш глибокі функціональні та точні вимірювання на додаток до зображення інтенсивності флуоресценції, щоб отримати молекулярну конформацію, міжмолекулярні взаємодії та молекулярне мікрооточення. інформацію, яку важко отримати за допомогою звичайного оптичного зображення.
Іншою важливою властивістю флуоресценції є Стоксів зсув, різниця в довжині хвилі між піками збудження та випромінювання (рис. 2). Зазвичай довжина хвилі випромінювання світла більша за довжину хвилі збудження. Це пов’язано з тим, що після того, як флуоресцентна речовина збудиться і перед тим, як вивільниться фотон, електрони втратять частину енергії через процес релаксації. Флуоресцентні речовини з більшим стоксовим зсувом легше спостерігати під флуоресцентним мікроскопом.
Флуоресцентні мікроскопи та блоки флуоресцентних фільтрів
Флуоресцентна мікроскопія — це оптичний мікроскоп, який використовує властивості флуоресценції для спостереження та зображення, і широко використовується в клітинній біології, нейробіології, ботаніці, мікробіології, патології, генетиці та інших областях. Флуоресцентне зображення має такі переваги, як висока чутливість і висока специфічність, і дуже підходить для спостереження за розподілом специфічних білків, органел тощо в тканинах і клітинах, вивчення спільної локалізації та взаємодії, а також відстеження динаміки життя. такі процеси, як зміни концентрації іонів.
Більшість молекул у клітинах не флуоресціюють, і щоб їх побачити, вони повинні бути флуоресцентно помічені. Існує багато методів флуоресцентного мічення, які можуть бути безпосередньо мічені (наприклад, використання DAPI для мічення ДНК), або імунофарбування з використанням антигензв’язуючих властивостей антитіл, або цільовий білок може бути позначений флуоресцентними білками (такими як GFP, зелений флуоресцентний білок), або оборотне зв'язування. синтетичні барвники (такі як Fura-2) тощо.
В даний час флуоресцентний мікроскоп став стандартним обладнанням для обробки зображень у різних лабораторіях і платформах для обробки зображень, і він є хорошим помічником у наших щоденних експериментах. Флуоресцентні мікроскопи в основному поділяються на три категорії: вертикальні флуоресцентні мікроскопи (придатні для розрізів), інвертовані флуоресцентні мікроскопи (підходять для живих клітин, враховуючи зрізи), флуоресцентні стереоскопічні мікроскопи (підходять для більших зразків, таких як рослини, даніо (дорослі/ ембріон), медака, органи миші/щура тощо).
Блок флуоресцентного фільтра є основним компонентом флуоресцентного зображення в мікроскопах. Він складається з фільтра збудження, емісійного фільтра та дихроичного світлорозділювача. Його встановлюють у колесо фільтра, наприклад Leica DMi8, оснащене 6-позиційним колесом фільтра (рис. 3). ). Різні мікроскопи мають різні положення колеса, а деякі мікроскопи використовують предметні скла.
Блок фільтра відіграє важливу роль у флуоресцентній візуалізації: фільтр збудження вибирає світло збудження для збудження зразка та блокує інші довжини хвилі світла; світло, що проходить через фільтр збудження, проходить через дихроїчний світлорозділювач (його роль полягає у відображенні збуджуючого світла та передачі флуоресценції). Після відбиття воно фокусується лінзою об’єктива, опромінюється на зразок, і відповідна флуоресценція збуджується до випромінювати світло. Випромінюване світло збирається лінзою об’єктива, проходить через дихроїчний світлорозділювач і досягає емісійного фільтра. Як показано на малюнку 4: довжина хвилі збудження становить 450-490 нм, дихроїчний розсіювач променя відбиває світло коротше ніж 510 нм, пропускає світло довше ніж 510 нм, а діапазон прийому випромінюваного світла становить 520-560 нм.
Флуоресцентні фільтри, які зазвичай використовуються у флуоресцентних мікроскопах, можна розділити на два типи: довгопрохідні (LP для коротких) і смугові (BP для коротких). Смуга пропускання зазвичай визначається центральною довжиною хвилі та шириною інтервалу, наприклад 480/40, що означає, що світло від 460-500 нм може проходити. Довгопрохідні фільтри, такі як 515 LP, пропускають світло з довжиною хвилі понад 515 нм (рис. 5).
Флуоресцентні речовини мають свою характерну криву збудження (поглинання) та криву випромінювання, пік збудження — це ідеальна довжина хвилі збудження (висока ефективність збудження, що може зменшити енергію збудження світла, захистити клітини та барвники), а крива випромінювання — це довжина хвилі випромінювання флуоресценції. діапазон. Тому в експерименті ми виберемо для збудження довжину хвилі якомога ближчу до піку збудження, а діапазон прийому повинен включати пік випромінювання. Наприклад, пік збудження Alexa Fluor 488 становить 500 нм, а фільтр збудження 480/40 можна вибрати у флуоресцентному мікроскопі.
Деталі кубиків-фільтрів можна переглянути в програмному забезпеченні для створення зображень мікроскопа. Розуміння барвників і пошук фільтра, який найкраще відповідає вашому зразку, має вирішальне значення для флуоресцентного зображення. Спектральна інформація флуоресцентних барвників і флуоресцентних білків зазвичай вказана в інструкціях, а також їх можна знайти в Інтернеті.
На додаток до довжин хвиль збудження та випромінювання флуоресцентних зондів, вибір блоків фільтрів також повинен враховувати наявність неспецифічного збудження та наявність перехресного кольору для багатоколірних мічених зразків. Крім того, необхідно враховувати джерело флуоресцентного освітлення, яке використовується. В даний час широко використовувані люмінесцентні джерела світла включають ртутні лампи, металогалогенні лампи та світлодіодні джерела світла, які швидко розвиваються в останні роки. Спектр флуоресцентного джерела світла є безперервним або переривчастим, і енергія буде різною в різних діапазонах довжин хвиль. Світлодіодне джерело світла поступово стає основним джерелом світла флуоресцентного мікроскопа завдяки його відносно вузькій спектральній смузі, більш стабільному виходу енергії, тривалому терміну служби, більш безпечному та екологічному захисту та багатьом іншим перевагам.
Крім вбудованого фільтруючого блоку мікроскопа є також зовнішнє швидкісне колесо (рис. 7). Швидкість перетворення фільтра, розташованого поруч із зовнішнім швидкісним колесом Leica, становить 27 мс, що дозволяє реалізувати високошвидкісні багатоколірні експерименти, такі як FRET і співвідношення кальцію Fura2. (рис. 8) та ін.
Широкий вибір методів візуалізації флуоресцентної мікроскопії
Щоб задовольнити різні потреби у флуоресцентній візуалізації, крім флуоресцентних мікроскопів, були розроблені різні рішення для флуоресцентної мікроскопії:
Широкопольні системи обробки зображень високої чіткості, такі як Leica THUNDER Imager, використовують інноваційну технологію Leica Clearing для ефективного видалення сигналів перешкод нефокальної площини під час зображення, представлення чітких зображень і переваг високошвидкісного зображення;
Конфокальний лазерний скануючий мікроскоп використовує точкові отвори для усунення інтерференції нефокальної площини, реалізує оптичне розділення та отримує зображення високої чіткості та тривимірні зображення;
Мікроскопи з надвисокою роздільною здатністю та наномікроскопи, які долають межу дифракції, можуть спостерігати тонкі структури менше 200 нм;
Багатофотонна система візуалізації, що використовує принцип багатофотонного збудження для візуалізації товстих тканин і глибоко in vivo;
Технологія створення світлих листів із високою часовою та просторовою роздільною здатністю, високою швидкістю зображення, високою роздільною здатністю, низькою фототоксичністю, особливо підходить для досліджень розвитку та динамічного спостереження in vivo;
Довічна флуоресцентна візуалізація (FLIM), на яку не впливають такі фактори, як концентрація флуоресцентної речовини, фотовідбілювання, інтенсивність збуджуючого світла тощо, може виконувати більш глибокі функціональні та точні вимірювання;
Флуоресцентна кореляційна спектроскопія (FCS) і флуоресцентна перехресна кореляційна спектроскопія (FCCS) вимірюють молекулярне число та коефіцієнт дифузії флуоресцентних молекул, таким чином аналізуючи молекулярну концентрацію, молекулярний розмір, в’язкість, молекулярний рух, молекулярне зв’язування/дисоціацію та молекулярні оптичні властивості;
Флуоресцентна мікроскопія з повним внутрішнім відображенням (TIRF) із надзвичайно високою роздільною здатністю по осі z ідеально підходить для вивчення молекулярної структури та динаміки поверхонь клітинних мембран.
