Різниця між (двофотонним, конфокальним) флуоресцентним мікроскопом та звичайним мікроскопом
Основний принцип двофотонного збудження полягає в тому, що при високій щільності фотонів флуоресцентні молекули можуть одночасно поглинати два фотони довгих довжин хвилі та випромінювати коротший фотон довжини хвилі після короткого періоду так званого часу збудженого стану; Ефект такий же, як використання фотона з половиною довжини хвилі довги довжини хвилі для збудження флуоресцентних молекул. Два збудження фотонів потребують високої щільності фотонів, і щоб уникнути пошкодження клітин, двофотонна мікроскопія використовує імпульсні лазери з високою енергією. Лазер, що випромінюється цим лазером, має високу пікову енергію та низьку середню енергію, з шириною імпульсу лише 100 фемтосекунд і частотою від 80 до 100 мегагерца. При використанні об'єктивної лінзи з високою чисельною діафрагмою для фокусування фотонів імпульсного лазера, щільність фотонів у фокусній точці об'єктивної лінзи є найвищою, а двофотонне збудження відбувається лише в фокусній точці об'єктивної лінзи. Тому двофотонний мікроскоп не потребує конфокальної пінолі, що підвищує ефективність виявлення флуоресценції.
У загальних явищах флуоресценції, завдяки низькій щільності фотона світла збудження, флуоресцентна молекула може поглинати лише один фотон за один раз, а потім випромінювати інший флуоресцентний фотон через радіаційний перехід, який відомий як одиночний фотон флуоресценція. Для процесів збудження флуоресценції з використанням лазерів як джерел світла можуть виникати двофотонні або навіть мультифотонні флуоресцентні явища. У цьому випадку використовуване джерело збудження має високу інтенсивність та щільність фотонів, що відповідає вимогам одночасно флуоресцентних молекул для поглинання двох фотонів. У процесі використання загального лазера в якості джерела світла збудження щільність фотонів все ще недостатня для отримання двофотонного явища поглинання. Зазвичай використовуються фемтосекундні імпульсні лазери, при цьому миттєва потужність досягає рівня мегаватів. Тому довжина хвилі двофотонної флуоресценції коротша, ніж у світла збудження, еквівалентна ефекту, що виникає шляхом збудження довжини хвилі збудження.
Знання, пов'язані з конфокальною флуоресцентною мікроскопією
Основним принципом конфокальної флуоресцентної мікроскопії є використання точкового джерела світла для опромінення зразка, утворюючи чітко визначене невелике світлове місце на фокусній площині. Флуоресценція, що випромінюється з цього місця після опромінення, збирається об'єктивним об'єктивом і надсилається назад по первісному шляху опромінення до спліттера променя, що складається з дихроїчного дзеркала. Спектрометр відправляє флуоресценцію безпосередньо до детектора. Перед джерелом світла та детектора, що називається підсвічуванням, і детектором, що виходить відповідно, є шпилька, що називається джерелом світла, так і детектором. Геометричні розміри двох послідовних, приблизно 100-200 нм; Порівняно зі світлим місцем на фокусній площині, вони сполучені, це означає, що світлове пляма проходить через ряд лінз і в кінцевому рахунку може зосередитись як на підсвічуванням, так і на виявленні шпильки одночасно. Таким чином, світло з фокусної площини може сходитися в межах отвору виявлення, а розсіяне світло зверху або нижче фокусної площини блокується поза отвором виявлення і не може бути зображено. Скануючи зразок точки за лазером, трубка фотопомнопліпера після виявлення шпильки також отримує відповідне конфокальне зображення точки світла за точкою, перетворює його в цифровий сигнал і передає його на комп'ютер і, нарешті, агрегує в чітке конфокальне зображення фокальної площини на екрані.
