Різниця між позитивним і негативним фазовим контрастом у мікроскопі
Залежно від конфігурації та природи фазового кільця, розташованого на задній фокальній площині об’єктива, зразки можна спостерігати з позитивним або негативним фазовим контрастом. У цьому інтерактивному посібнику вивчається взаємозв’язок між об’ємним звуком (S), дифракцією (D) і результуючими яскравими частинками (P-хвилі), а також позитивною та негативною фазово-контрастною мікроскопією. Крім того, також представлено геометрію фазової пластини та репрезентативні зображення зразків.
Коли люди зараз використовують це у своїй роботі, більшість дослідників мають негативну різницю, а зараз позитивна різниця не відіграє великої ролі в поточній науково-дослідній роботі.
Підручник ініціалізує фазове зображення випадково вибраним зразком, який з’являється у вікні Phase Contrast Image, а відповідне хвильове співвідношення показано ліворуч у вікні зображення. Щоб працювати з підручником, використовуйте курсор миші для переміщення між позитивним і негативним фазовим контрастом або повзунком фазового контрасту яскравого освітлення. Коли повзунок переміщується, зображення, які з’являються у вікні зображення фазового контрасту, змінюють вигляд зразка в поточному режимі зображення, встановленому повзунком. Крім того, під графіком форми сигналу є фазова пластина, яка змінює форму відповідно до режиму зображення, вибраного повзунком. Щоб переглянути новий зразок, скористайтеся спадним меню «Вибраний зразок», щоб вибрати інший зразок.
Графік конфігурації фазової пластини, хвильових співвідношень і векторів, пов’язаних із створенням позитивних і негативних зображень фазового контрасту, представлено на рисунку 1. Також показано приклади зразків, зображених цими методами. У позитивній фазово-контрастній оптичній конфігурації (верхній ряд зображення на малюнку 1) фронт хвилі (S) проходить через фазову пластину, що призводить до чистого зсуву фази на 180 градусів по фазі на 1/4 довжини хвилі ( 1 півдовжини хвилі). Удосконалені об’ємні хвильові фронти тепер можуть брати участь у руйнівній інтерференції з дифрагованими (D) хвилями в проміжній площині зображення. У більшості випадків простого просування відносної фази навколишнього хвильового фронту недостатньо для створення висококонтрастних зображень у мікроскопах Nikon. Це пояснюється тим, що амплітуда об’ємних хвиль значно більша, ніж амплітуда дифрагованих хвиль, і пригнічує результуюче зображення, створене інтерференцією від частки загальної кількості хвиль. Щоб зменшити навколишній хвильовий фронт до значення, ближчого до амплітуди дифрагованих хвиль (і здійснити інтерференцію в площині зображення), непрозорість у фазовому кільці об’єктива досягається шляхом нанесення напівпрозорого металу (нейтрального збільшення щільності). ) покриття Пол. Навколишні світлові хвилі, які за проектом майже повністю проходять через фазове кільце, під фазово-контрастною мікроскопією, значно зменшуються в амплітуді через непрозорість фазової пластини до значення в діапазоні від 10 до 30 відсотків від початкової інтенсивності.
Оскільки результуюча частинкова хвиля створюється інтерференцією* навколишніх і дифрагованих хвильових фронтів, амплітуда часткової (P) хвилі, створюваної інтерференцією між хвильовими фронтами, що надходять у площину зображення, тепер набагато менша, ніж навколишній, коли в сексуальному нанесене покриття щільності. Загальний ефект полягає в перетворенні відносної різниці фаз, створеної проходженням світла, що виходить із площини зображення через зразок, на різницю в амплітуді (інтенсивності). Оскільки людське око інтерпретує різницю в інтенсивності як контраст, зразок тепер видно в окулярі мікроскопа, а також може бути захоплений на мембрану за допомогою звичайних систем камер або в цифровому вигляді за допомогою пристроїв CCD або CMOS. Усі системи позитивного фазового контрасту вибірково збільшують фазу лінійного фронту хвилі об’ємного (S) відносно фронту сферичної дифрагованої хвилі (D). Зразки з вищим показником заломлення, ніж навколишнє середовище, виглядають темнішими на нейтрально-сірому фоні, тоді як зразки з нижчим показником заломлення, ніж плаваюче середовище, виглядають яскравіше, ніж на сірому фоні.
Щоб змінити просторове розділення дифрагованих хвильових фронтів, що оточують фазу та амплітуду в оптичній системі фазового контрасту, було введено кілька конфігурацій фазової пластини. Оскільки фазова пластина розташована на задній фокальній площині об’єктива (дифракційній площині) або дуже близько до неї, усе світло, яке проходить через мікроскоп, має проходити через цей компонент. Частина фазової пластини в її кільцевому фокусі конденсатора називається спряженою областю, а решта області називається комплементарною областю. Спряжена область містить матеріал, відповідальний за зміну фази навколишнього (недифрагованого) світла на плюс або мінус 90 градусів по відношенню до дифрагованого хвильового фронту. Загалом площа фазово-спряженого кільця ширша (приблизно на 25 відсотків), ніж область, визначена зображенням кільця конденсації, щоб зменшити кількість навколишнього світла, яке поширюється на комплементарну область.
Більшість фазових пластин, доступних сучасними виробниками мікроскопів, є одними з пластин, виготовлених шляхом вакуумного осадження тонких діелектричних і металевих плівок на скляну пластину або встановлених безпосередньо на поверхні лінзи об’єктива мікроскопа. Роль діелектричної плівки полягає у фазуванні світла, тоді як металева плівка послаблює інтенсивність недифрагованого світла. Деякі виробники використовують кілька антиблікових покриттів у поєднанні з плівкою, щоб зменшити кількість відблисків і відбиття розсіяного світла назад в оптичну систему. Якщо фазова пластинка не утворена на поверхні лінзи, вона зазвичай цементується між послідовними лінзами, які знаходяться у фокальній площині біля задньої частини об’єктива. Товщина та показник заломлення діелектричного, металевого та антиблікового покриття, а також оптичного цементу ретельно підібрані для отримання бажаного фазового зсуву між комплементарними та спряженими областями фазової пластини. З точки зору оптики, фазова пластина, яка змінює фазу відносно навколишнього світла, щоб дифрагувати світло на 90 градусів (позитивну чи негативну), називається чвертьхвильовою пластиною через вплив на неї оптичної різниці шляху.
Огляд інверсії позитивної фази показано на рисунку 1. Контрастна пластина позитивної фази (ліва сторона малюнка 1) розштовхує об’ємну хвилю на 1/4 довжини хвилі завдяки кільцю ерозії в скляній пластині, яке може бути зменшено за рахунок верхнього проходу в пластині з високим індексом Фізичний шлях хвилі. Через взаємодію зі зразком, коли дифраговані промені зразка (D) затримуються, різниця оптичного шляху між оточуючими та дифрагованими хвилями, які виходять із фазової пластини, становить половину довжини хвилі на 1/4 довжини хвилі. Кінцевим результатом є 180-градусна різниця оптичного шляху між навколишніми та дифрагованими хвилями, що призводить до руйнівної інтерференції для зразків із високим показником заломлення між площинами зображення. Амплітудна крива позитивної фази, протилежної руйнівній інтерференційній хвилі, показана на верхньому графіку рисунка 1. Результуюча частинкова (P) хвиля має меншу амплітуду, ніж об’ємна (S) хвиля, завдяки чому об’єкт виглядає порівняно з відносно темніший фон. Внизу зображення зелених водоростей Zygnema, показано праворуч (позначене DL). Вектор, представлений прогресом 1/4 довжини хвилі, який показаний у вигляді об’ємної хвилі, що обертається проти годинникової стрілки на 90-градуси, у позитивному фазовому контрасті, з’являється між фігурою та зображенням на рисунку 1.
Крім того, оптику мікроскопа також можна виготовити для створення протилежної негативної фази, як показано в нижній частині рисунка 1, і в цьому випадку об’ємні (S)-хвилі затримуються (а не просуваються) на чверть довжини хвилі відносно на одна дифрагована (D) хвиля. У результаті зразки з високим показником заломлення виглядають яскравішими на темно-сірому фоні (див. нижнє зображення з позначкою BM на малюнку 1). У протилежній негативній фазі об’єктивна фазова пластина містить підняте кільце, яке затримує фазу (а не просуває фазу як протилежну позитивну фазу), пропускаючи чверть довжини хвилі відносно фази дифрагованої хвилі як об’ємну хвилю нульового порядку. Оскільки дифраговані хвилі були затримані на чверть довжини хвилі, коли вони проходили крізь зразок, різниця оптичного шляху між навколишніми та дифрагованими хвилями усувається, і зразок з високим показником заломлення створює конструктивні інтерференції в площині зображення. Зауважте, що результуюча хвиля частинок (P) має вищу амплітуду, ніж об’ємна хвиля (S) у негативному фазовому контрасті. Також показана негативна реверсія фази, коли кругосвітній хвильовий вектор проходить через обертання векторної діаграми на 90 градусів за годинниковою стрілкою.
