Технічні характеристики та навички використання двофотонного флуоресцентного мікроскопа
Двофотонна флуоресцентна мікроскопія — це нова технологія, яка поєднує лазерну скануючу конфокальну мікроскопію та технологію двофотонного збудження.
Основний принцип двофотонного збудження такий: у разі високої щільності фотонів флуоресцентні молекули можуть поглинати два довгохвильові фотони одночасно та випромінювати короткохвильовий фотон після короткого періоду так званого збудженого стану. . ; Ефект такий самий, як використання фотона з довжиною хвилі, яка вдвічі менша за довгу, для збудження флуоресцентної молекули. Для двофотонного збудження потрібна висока щільність фотонів. Щоб не пошкодити клітини, у двофотонній мікроскопії використовуються високоенергетичні імпульсні лазери з синхронізованим режимом. Лазер, випромінюваний цим лазером, має високу пікову енергію та низьку середню енергію, ширина його імпульсу становить лише 100 фемтосекунд, а його період може досягати 80-100 мегагерц. При використанні об’єктива з високою числовою апертурою для фокусування фотонів імпульсного лазера щільність фотонів у фокальній точці лінзи об’єктива є найвищою, а двофотонне збудження виникає лише в фокальній точці лінзи об’єктива, тому двофотонний мікроскоп не потребує конфокального отвору, що покращує ефективність виявлення флуоресценції. Це важливий метод дослідження в галузях морфології, молекулярної клітинної біології, неврології та фармакології.
1. Передумови появи двофотонної мікроскопії – два обмеження традиційної лазерної конфокальної мікроскопії:
1) Одним з них є явище фототоксичності: оскільки конфокальна точкова дірка має бути достатньо маленькою, щоб отримати зображення з високою роздільною здатністю, а мала апертура блокуватиме значну частину флуоресценції, що випромінюється зразком, включаючи флуоресценцію, що випромінюється з фокальної площини, відповідне Так, світло збудження має бути достатньо сильним, щоб отримати достатнє відношення сигнал/шум; і лазер високої інтенсивності спричинить швидке згасання флуоресцентного барвника під час безперервного сканування, а флуоресцентний сигнал ставатиме все слабшим і слабшим у міру просування сканування.
2) Фототоксичність є іншою проблемою. Під лазерним опроміненням багато молекул флуоресцентного барвника вироблятимуть цитотоксини, такі як синглетний кисень або вільні радикали, тому час сканування та щільність оптичної потужності збуджуючого світла повинні бути обмежені в експерименті, щоб підтримувати щільність зразка. активний. У дослідженнях на активних зразках, особливо на різних стадіях росту та розвитку активних зразків, фотовідбілювання та фототоксичність роблять ці дослідження дуже обмеженими.
2. Чому ви стверджуєте, що двофотонні мікроскопи зазвичай не потребують оснащення ультрафіолетовими лазерами збудження?
Двофотонна мікроскопія — це технологія збудження флуоресценції, заснована на ефекті двофотонного збудження: молекули флуоресцентного барвника можна збуджувати шляхом поглинання двох низькоенергетичних фотонів одночасно (проміжок часу між двома фотонами, які досягають флуоресцентних молекул, становить менше 1 фемтосекунди). ), його ефект збудження може бути еквівалентним поглинанню фотона високої енергії з 1/2 довжини хвилі. Наприклад, поглинання двох фотонів на червоних довжинах хвиль еквівалентно поглинанню молекулою ультрафіолету. Довгохвильові фотони нелегко поглинаються клітинами, тому фототоксичність для живих клітин зменшується, а також зменшується фотовідбілювання. Таким чином, він не тільки виконує функцію ультрафіолетового збудження, але й запобігає пошкодженню ультрафіолетового світла зразка.
3. У чому особливість лазера двофотонного мікроскопа?
Імовірність двофотонного поглинання залежить від того, наскільки близько два падаючі фотони збігаються в просторі та часі (два фотони мають прибути протягом 10-18 секунд). Перетин двофотонного поглинання малий, і збуджуються лише флуорофори в областях з великим потоком фотонів. Таким чином, більшість використовуваних лазерів є титан-сапфіровими лазерами, які можуть досягати пікосекундної або фемтосекундної швидкості сканування та мають дуже високу пікову потужність і низьку середню потужність, так що фотовідбілювання та фототоксичність можуть бути зменшені або усунені. Найголовніше - це забезпечити дуже високу щільність фотонів у малому діапазоні, яка може забезпечити одночасне збудження двох фотонів.
4. Які переваги має двофотонне збудження?
1) Збільште селективність барвника: діапазон збудження світла лазера конфокальної системи (Ar, Ar/Kr, HeNe) становить 488 нм - 647 нм. Це означає експериментувати з флуоресцентними барвниками, що збуджуються ультрафіолетом, наприклад, з DAPI, Hoescht. Довжина хвилі збудження двох фотонів вдвічі більша, ніж однофотонів, тому барвники, збуджені ультрафіолетом, можуть збуджуватися ближнім інфрачервоним світлом.
2) Зменшення фотовідбілювання: завдяки зменшенню фотовідбілювання підвищується відсоток успіху експериментів із використанням CFP/YFP для флуоресцентного резонансного переносу енергії (FRET).
3) Спеціальний об’єктив не потрібен: з апаратної точки зору збудження барвників, збуджених УФ-випромінюванням, довжиною хвилі ближнього інфрачервоного світла не потребує спеціальних оптичних УФ-компонентів.
4) Поліпшення співвідношення сигнал/шум: довжина хвилі збудження світла та довжина хвилі випромінюваного світла мають велику різницю, що покращує співвідношення сигнал/шум.
5) Знебарвлення, локалізоване у фокальній точці: оскільки збудження флуоресценції відбувається лише у фокальній точці об’єктива, немає потреби у конфокальній точці. Це покращує виявлення світла, а фотовідбілювання відбувається лише в точці фокусу.
6) Легше проникнення в зразки: інфрачервоне світло нелегко розсіюється клітинами і може проникати глибше в зразки.
5. Яке найбільше вдосконалення двофотонної мікроскопії порівняно з лазерною скануючою конфокальною мікроскопією?
1) Зменшення фотовідбілювання.
2) Знижена фототоксичність.
3) Непросто розкидати, а легше пробити товсті зразки, як-от зрізи мозку.
