Методи фарбування та мікроскопічного спостереження мікроорганізмів
1. Мета
1.1 Ознайомтеся з основними методами отримання мікробних мазків і фарбування.
1.2 Оволодіти простим методом фарбування бактерій.
1.3 Попередньо усвідомити морфологічні характеристики бактерій, закріпити знання про використання масляних лінз і техніку асептичної роботи.
2 Принципи
Розмазування та фарбування бактерій є основною технікою мікробіологічних експериментів. Бактеріальні клітини малі та прозорі, тому їх важко ідентифікувати під звичайним світловим мікроскопом; їх необхідно пофарбувати. Один барвник використовується для фарбування бактерій, щоб пофарбовані бактерії чітко відрізнялися кольором від фону, щоб можна було чіткіше спостерігати їх морфологію та структуру. Цей метод простий у використанні і підходить для спостереження за загальною формою бактеріальних клітин і розташуванням бактерій. Базові барвники зазвичай використовуються для простого фарбування. Це пояснюється тим, що в нейтральних, лужних або слабокислих розчинах бактеріальні клітини зазвичай негативно заряджені, а коли основні барвники іонізуються, фарбувальна частина їх молекул заряджається позитивно, тому вони є лужними. Фарбувальна частина барвника легко поєднується з бактеріями, забарвлюючи їх. Пофарбовані бактеріальні клітини різко контрастують із фоном, що полегшує їх ідентифікацію під мікроскопом. Барвники, які зазвичай використовуються для простого фарбування, включають метиленовий синій, кристалічний фіолетовий, основний фуксин тощо. Коли бактерії розкладають цукор і виробляють кислоту, що спричиняє зниження рН культурального середовища, позитивний заряд бактерій збільшується. У цей час для фарбування можна використовувати кислі барвники, такі як еозин, кислий фуксин або конго червоний. Перед фарбуванням необхідно провести фіксацію бактерій. Він має дві мети: одна — знищити бактерії та змусити їх прилипнути до предметного скла; інший - збільшити їх спорідненість з барвниками. Два широко використовувані методи - це нагрівання та хімічна фіксація. При фіксації намагайтеся зберегти первісну форму клітин.
3 матеріали
3.1 Бактерії: Bacillus subtilis 12-18h поживна культура на агарі, Staphylococcus aureus 24h поживна культура на агарі, Escherichia coli 24h на поживному агарі, пекарські дріжджі на агарі.
3.2 Фарбник: лужний метиленовий синій барвник Лу (або кристалічний фіолетовий барвник оксалат амонію), фуксиновий барвник карболової кислоти.
3.3 Інструменти та інший посуд: мікроскоп, спиртівка, предметне скло, петля для посіву, підставка для предметних стекол, двошарова пляшка (з кедровою олією та ксилолом), серветка для лінз, фізіологічний розчин або дистильована вода тощо.
4. Процес: мазок → сушіння → фіксація → фарбування → промивання → сушіння → мікроскопічне дослідження.
5 кроків
5.1 Мазок: Візьміть два чистих і знежирених предметних скла. У стерильних умовах помістіть невелику краплю фізіологічного розчину (або дистильованої води) на кожну центральну частину предметного скла. Використовуйте інокуляційну петлю для стерилізації бактерій Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus і Escherichia coli, наберіть трохи бактеріального газону в краплі води на похилому місці, добре перемішайте і нанесіть тонкою плівкою. Якщо ви використовуєте бактеріальну суспензію (або рідку культуру) мазка, ви можете використовувати інокуляційну петлю, щоб вибрати 2-3 петлі та нанести їх безпосередньо на предметне скло. Будьте обережні, не капніть занадто багато фізіологічного розчину (дистильованої води), видаліть бактерії та нанесіть його рівномірно та не надто густо.
5.2 Сушіння Сушіть природним шляхом при кімнатній температурі. Ви також можете трохи нагріти його над спиртівкою стороною з покриттям догори, щоб висушити. Але не наближайтеся до вогню занадто близько, оскільки занадто висока температура зруйнує морфологію бактерій.
5.3 Фіксація Якщо використовується сушіння з нагріванням, фіксація та сушіння поєднуються в один етап, а метод такий самий, як і сушіння. Намажте, висушіть і закріпіть термо.
5.4 Фарбування: помістіть предметне скло на підставку для предметних стекол і додайте 1–2 краплі розчину барвника на мазок (доречно, щоб розчин барвника лише покривав плівку мазка). Забарвлюйте основним метиленовим синім Лу протягом 1-2 хвилин, а потім забарвлюйте фуксином карболової кислоти (або кристалічним фіолетовим оксалатом амонію) приблизно 1 хвилину.
5.5 Промивання водою: вилийте розчин барвника та обережно промийте предметне скло водопровідною водою з одного кінця, доки вода, що стікає з мазка, не стане безбарвною. Під час миття водою не мийте покриту поверхню безпосередньо водою. Потік води не повинен бути надто швидким або надто великим, щоб запобігти відпаданню мазкової плівки.
5.6 Сушіння: Струсіть краплі води на предметному склі та висушіть природним шляхом, висушіть феном або промокніть абсорбуючим папером (обережно, щоб не витерти бактерії). 5.7 Мікроскопічне дослідження Після висихання мазка виконайте мікроскопічне дослідження. Мазок повинен повністю висохнути перед переглядом за допомогою масляної лінзи.
6 Результати Намалюйте морфологію E. coli та Micrococcus luteus, які спостерігаються після однократного фарбування.
