Техніка фарбування та мікроскопічного спостереження мікроорганізмів
Просте фарбування бактерій
1 Цілі
1.1 Навчитися основним методикам мікробного мазка та фарбування.
1.2 Оволодіти простим методом фарбування бактерій.
1.3 Ознайомитись з морфологічними особливостями бактерій, закріпити знання використання масляного дзеркала та техніки асептичної роботи.
2 Принцип Мазок і фарбування бактерій є основною технікою в мікробіологічних експериментах. Клітини бактерій маленькі і прозорі, їх нелегко розпізнати під звичайним світловим мікроскопом, і їх необхідно фарбувати. Використання одного барвника для фарбування бактерій, щоб пофарбований організм і фон утворювали чітку різницю кольорів, щоб їх морфологію та структуру можна було чіткіше спостерігати. Цей метод простий у виконанні і підходить для спостереження за загальною формою організму та розташуванням бактерій. Лужні барвники зазвичай використовуються для простого фарбування, оскільки в нейтральних, лужних або слабокислих розчинах бактеріальні клітини зазвичай негативно заряджені, а коли лужні барвники іонізуються, фарбувальна частина їх молекул заряджається позитивно, тому фарбувальна частина лужних барвників може легко зв’язуватися з бактеріями, забарвлюючи бактерії. Пофарбовані бактеріальні клітини різко контрастують із фоном, і їх легше розпізнати під мікроскопом. Зазвичай використовувані барвники для простого фарбування включають мероціаніновий синій, кристалічний фіолетовий і основний червоний. Коли бактеріальне розкладання цукру з утворенням кислоти так, що рН середовища зменшується, позитивний заряд бактерій збільшується, а потім можна використовувати для фарбування червоним, кислим червоним або конго червоним та іншими кислими барвниками. Бактерії необхідно зафіксувати перед фарбуванням. Його призначення подвійне: одне — знищити бактерії та змусити бактерії прилипнути до предметного скла; другий - збільшити його спорідненість з барвником. Зазвичай використовуються два методи: нагрівання та хімічна фіксація. Намагайтеся зберегти вихідну морфологію клітин при фіксації.
3 Матеріали
3.1 Штам Bacillus subtilis 12-18h живильний агар скошеної культури, Staphylococcus aureus близько 24 год поживної агаризованої культури, Escherichia coli 24h поживної агаризованої культури скошеної культури пекарських дріжджів.
3.2 Забарвлення Лужне забарвлення метиленовим синім (або забарвлення оксалатом амонію кристалічним фіолетовим), забарвлення сполуки карболової кислоти червоне забарвлення.
3.3 Інструменти та інше обладнання Мікроскоп, спиртівка, предметне скло, кільце для інокуляції, тримач для предметного скла, двошаровий флакон (заповнений кедровою олією та ксилолом), папір для мікроскопа, фізіологічний розчин або дистильована вода тощо.
4 Процедура Мазок → висушування → фіксація → фарбування → промивання → висушування → мікроскопічне дослідження.
5 кроків
5.1 мазок Візьміть два чистих і знежирених предметних скла, кожне з невеликою краплею фізіологічного розчину (або дистильованої води) у центрі предметного скла в асептичних умовах, з інокуляційним кільцем для асептичної роботи, відповідно, з Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus і Escherichia coli нахилі, щоб вибрати трохи моху в краплі води, перемішати і покрити плівкою. Якщо бактеріальну суспензію (або рідку культуру) мазка, можна використати для інокуляції кільця вибрати 2-3 кільця безпосередньо на предметному склі. Зверніть увагу, що фізіологічного розчину (дистильованої води) і брати бактерії слід не дуже багато і розподіляти рівномірно, не дуже густо.
5.2 Сушіння Сушити природним шляхом при кімнатній температурі. Його також можна висушити, трохи нагрівши над спиртівкою стороною з покриттям догори. Однак не наближайтеся до вогню надто близько, тому що занадто висока температура зруйнує морфологію бактерій.
5.3 Фіксація Якщо використовується теплове сушіння, фіксація та сушіння поєднуються в один етап так само, як і сушіння. Намажте, висушіть і закріпіть теплом.
5.4 Фарбування Помістіть предметне скло на полицю для предметних стекол, додайте 1-2 краплі розчину для фарбування на мазок (розчин для фарбування лише покриває плівку мазка). Забарвлюйте мазок засобом Lü's Basic Mellanox Blue протягом 1~2 хвилин і за допомогою карбонатно-червоного (або амонійно-оксалатного кристалічного фіолетового) приблизно 1 хвилину.
5.5 Промивання. Злийте фарбувальний розчин і обережно промийте предметне скло водопровідною водою з одного кінця, доки вода, що стікає з мазка, не стане безбарвною. Під час промивання не дозволяйте воді текти безпосередньо для миття покритої поверхні. Потік води не повинен бути надто швидким або надто великим, щоб уникнути зміщення плівки мазка.
5.6 Висушування. Струсіть краплі води на предметному склі, щоб висохнути природним шляхом, висушіть феном або використовуйте абсорбуючий папір, щоб поглинути суху (будьте обережні, щоб не витерти тіло бактерії). 5.7 Мікроскопічне дослідження Мазок висушують і досліджують під мікроскопом. Мазок повинен бути повністю сухим, перш ніж його можна буде спостерігати за допомогою масляного мікроскопа.
6 Результати Намалюйте морфологію E. coli та Micrococcus garciniae після одноразового фарбування.
Пляма за Грамом
1 Мета
1.1 Зрозуміти принцип фарбування за Грамом і його значення для класифікації та ідентифікації бактерій.
1.2 Вивчити та засвоїти техніку фарбування за Грамом та закріпити навчене використання масляної лінзи світлового мікроскопа.
