Вимоги до підготовки зразків для флуоресцентної мікроскопії
Вимоги до підготовки препарату для флуоресцентної мікроскопії
(1) Предметне скло
Товщина предметного скла має становити 0.8-L2 мм. Занадто товсте предметне скло поглинатиме більше світла, з одного боку, і не зможе сфокусувати світло збудження на зразку, з іншого боку. Предметні скла мають бути гладкими, однакової товщини та без явної автофлуоресценції. Іноді використовують кварцові гірки.
(2) Покривне скло
Товщина покривного скла становить приблизно 0,17 мм, гладке. Для посилення збуджуючого світла також можна використовувати інтерференційне покривне скло, яке є спеціальним покривним склом, покритим декількома шарами речовин (наприклад, фториду магнію), які мають різну інтерференційну дію на світло різних довжин хвиль, що може призвести до гладка флуоресценція. Світло збудження пропускається, і світло збудження відбивається, і це відбите світло збудження може збудити зразок.
(3) Зразок
Зрізи тканин або інші зразки не повинні бути надто товстими. Якщо товщина надто велика, більша частина збуджуючого світла споживатиметься в нижній частині зразка, тоді як верхня частина, яка безпосередньо спостерігається лінзою об’єктива, не може повністю збуджуватися. Крім того, флуоресценція, спричинена накладанням клітин або домішками, фонове неспецифічне фарбування впливає на судження.
(4) дзеркальна олія
Як правило, під час спостереження за зразками за допомогою темнопольних флуоресцентних мікроскопів і масляних імерсійних мікроскопів необхідно використовувати імерсійну олію. Найкраще використовувати спеціальне нефлуоресцентне іммерсійне масло. Замість нього також можна використовувати гліцерин, а також рідкий парафін, але показник заломлення низький, що незначно впливає на якість зображення.
Розуміння світлового куба флуоресцентної мікроскопії
Флуоресценція — це світло, при якому електрони в речовині поглинають світлову енергію зі стану низької енергії в стан високої енергії, а потім випускають світло, коли вона повертається до стану низької енергії. Це безтемпературне випромінюване світло — люмінесценція. Тобто: речовина поглинає короткохвильове світло, переходить у збуджений стан і випромінює довгохвильове світло.
Незалежно від того, чи це автофлуоресценція речовини, флуоресцентного барвника чи флуоресцентного білка, що експресується шляхом злиття, його потрібно збуджувати певною довжиною хвилі світла (збудження). Після того, як електрони мігрують і втрачають енергію, вони випромінюють світло з певною довгою довжиною хвилі (випромінювання). , які можуть бути зібрані системою виявлення для досягнення функції ідентифікації специфічної флуоресценції.
Що таке люмінесцентний світловий куб?
Під час спостережень під флуоресцентним мікроскопом і візуалізації збуджуюче світло певної довжини хвилі та відповідне довгохвильове випромінювання світла забезпечуються флуоресцентним світловим кубом, так що флуоресцентний сигнал можна отримати неозброєним оком, екраном дисплея або камерою. Таким чином, флуоресцентний світловий куб визначає, що може бути виявлено Ключовий пристрій флуоресцентного сигналу, його характеристики включають EX: параметри фільтра довжини хвилі збудження, EM: параметри фільтра довжини хвилі випромінювання та DM: параметри дихотомічного дзеркала. Візьмемо, наприклад, світловий куб DAPI вбудованого флуоресцентного мікроскопа Revolve, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425 нм світло може бути передано до EM; Фільтри електромагнітного випромінювання використовуються для відділення флуоресценції, випромінюваної флуорофором, від інших фонових оптичних елементів для відділення світла. Емісійні фільтри пропускають світло на довжині хвилі флуоресценції через дихроїчне дзеркало, одночасно блокуючи все інше світло, яке просочується від джерела збудження (відбите від зразка чи оптики). Довжина хвилі випромінюваного світла є більшою за спостережувану ЕМ, тобто в систему виявлення потрапляє лише світло в діапазоні 450±25 нм. Правильний вибір фільтрів EX, EM і дихотомії DM може допомогти дослідникам досягти вищого співвідношення сигнал/шум (S/N).
