Принципи лазерної конфокальної мікроскопії (LSCM)
Лазерний конфокальний мікроскоп використовує отвір для освітлення, розміщений за джерелом світла, і отвір для виявлення, розміщений перед детектором, для досягнення точкового освітлення та точкового виявлення. Світло від джерела світла фокусується на точці у фокальній площині зразка за допомогою світла, випромінюваного через отвір для освітлення, і флуоресценція, що випромінюється з цієї точки, відображається всередині отвору для виявлення, а будь-яке світло, що випромінюється поза цією точкою, блокується виявлення точкового отвору. Точковий отвір освітлення та отвір виявлення є сполученими для освітленої або виявленої точки, так що виявлена точка є конфокальною точкою, а площина, де розташована виявлена точка, є конфокальною площиною. Комп’ютер відображає виявлену точку на екрані комп’ютера у вигляді зображення точки. Щоб створити повне зображення, система сканування на оптичному шляху сканує фокальну площину зразка, створюючи таким чином повне конфокальне зображення. Поки носій столика переміщується вгору та вниз уздовж осі Z, новий рівень зразка переміщується до конфокальної площини, і новий рівень зразка відображається на моніторі, оскільки вісь Z продовжує рухатися рухаються, отримують послідовні світлові зображення різних рівнів зразка.
У традиційному оптичному мікроскопі використовується польове джерело світла, зображення кожної точки на зразку буде заважати дифракції або розсіюванню світла від сусідніх точок; лазерний скануючий конфокальний мікроскоп використовує лазерний промінь через освітлену точкову точку для формування точкового джерела світла на зразку, сканованому в кожній точці внутрішньої фокальної площини, зразка в опроміненій точці, зображення детекторної точкової отвору, шляхом виявлення точкового отвору після світлової мультиплікаційної трубки (ФЕУ) або пристрою з холодним електрозв’язком (cCCD). Отримане точкове або рядкове зображення на екрані монітора комп’ютера швидко формується флуоресцентне зображення. Точка підсвічування та отвір виявлення по відношенню до фокальної площини лінзи об’єктива є сполученими, точка на фокальній площині одночасно зосереджена на точці освітлення та точці випромінювання, точка за межами фокальної площини не буде при виявленні отвір на зображенні, щоб отримане конфокальне зображення було оптичним поперечним перерізом зразка, подолавши недоліки нечіткого зображення звичайного мікроскопа.
З основного принципу лазерний конфокальний мікроскоп є сучасним оптичним мікроскопом, це звичайний світловий мікроскоп із технологією, щоб зробити наступні вдосконалення.
1. Використовуйте лазер як джерело світла, оскільки монохроматичність лазера дуже хороша, довжина хвилі променя джерела світла однакова, що принципово усуває хроматичну аберацію.
2. Використання конфокальної технології у фокальній площині лінзи об’єктива, розміщеної посередині з невеликим отвором у перегородці, фокальна площина за межами блокує розсіяне світло, усуваючи сферичну аберацію; і додатково усунути хроматичну аберацію.
3. Лазерний конфокальний мікроскоп із використанням технології точкового сканування для розкладання зразка на двовимірний або тривимірний простір на незліченну кількість точок за допомогою дуже маленького лазерного променя (точкового джерела світла) точково, лінія за лінією скануючого зображення, а потім через мікрокомп'ютерна комбінація цілої площини або тривимірного зображення. Традиційний світловий мікроскоп є польовим джерелом світла під одноразовим зображенням, зразки на кожній точці зображення будуть прилягати до точки дифрагованого світла та інтерференції розсіяного світла. Чіткість і точність цих двох зображень неможливо порівняти.
4. Отримання та обробка оптичних сигналів за допомогою комп'ютера та посилення сигналів за допомогою фотоелектронного помножувача.
У лазерному конфокальному мікроскопі комп’ютер замінює людське око або камеру для спостереження та відеозапису, а отримані зображення оцифровуються та можуть бути оброблені в комп’ютері, щоб знову покращити чіткість зображень. Крім того, використання фотоелектронних помножувачів може посилювати дуже слабкі сигнали, значно покращуючи чутливість. В результаті спільного використання вищезазначених технологій можна сказати, що LSCM є найдосконалішим мікроскопом у світі. Можна сказати, що LSCM - це поєднання технології виробництва мікроскопів, фотоелектричних технологій, комп'ютерних технологій **, є неминучим продуктом розвитку сучасних технологій.
