Принцип і конструкція флуоресцентного мікроскопа
Флуоресцентний мікроскоп використовує точкове джерело світла високої світлової ефективності, яке випромінює певну довжину хвилі світла (наприклад, ультрафіолетове світло 3650 дюймів або фіолетово-блакитне світло 4200 дюймів) через систему кольорової фільтрації як світло збудження та збуджує флуоресцентні речовини у зразку до випромінюють різні кольори флуоресценції. Після цього спостерігають через збільшення об’єктива та окуляра. Таким чином, навіть із слабкою флуоресценцією, він легко розпізнається та є високочутливим на сильному контрастному фоні, головним чином використовується для вивчення клітинної структури та функції, а також хімічного складу. Основна структура флуоресцентного мікроскопа складається зі звичайного оптичного мікроскопа та деяких аксесуарів (таких як флуоресцентне джерело світла, фільтр збудження, біхроматичний роздільник пучка, блокуючий фільтр тощо). Люмінесцентні джерела світла - зазвичай використовують ртутні лампи надвисокого тиску (50-200W), які можуть випромінювати світло різної довжини хвилі. Однак кожна флуоресцентна речовина має довжину хвилі збуджуючого світла, яка створює найсильнішу флуоресценцію, тому потрібно додати збуджуючі фільтри (зазвичай ультрафіолетові, фіолетові, сині та зелені збуджуючі фільтри), щоб дозволити лише певній довжині хвилі збуджувального світла проходити та освітлювати зразок, поглинаючи все інше світло. Після опромінення збудженим світлом кожна речовина випромінює видиму флуоресценцію з більшою довжиною хвилі, ніж опромінення, за дуже короткий проміжок часу. Флуоресценція має специфічність і, як правило, слабша, ніж світло збудження. Щоб спостерігати специфічну флуоресценцію, за лінзою об’єктива потрібно додати блокуючий (або пригнічуючий) фільтр. Він виконує дві функції: по-перше, він поглинає та блокує збуджувальне світло від потрапляння в окуляр, щоб уникнути порушення флуоресценції та пошкодження очей; по-друге, він вибирає та пропускає певну флуоресценцію, відображаючи певний колір флуоресценції. Обидва типи фільтрів повинні бути обрані для спільного використання.
Існує два типи флуоресцентних мікроскопів залежно від їх оптичного шляху:
1. Трансмісійний флуоресцентний мікроскоп: джерело збудження світла пропускається через матеріал зразка через конденсор для збудження флуоресценції. Зазвичай використовувані колектори темного поля або звичайні колектори світла можна використовувати для налаштування рефлектора для перетворення збуджуючого та бічного світла на зразок. Це відносно старомодний флуоресцентний мікроскоп. Його перевага полягає в тому, що флуоресценція є сильною при малому збільшенні, а недоліком є те, що флуоресценція слабшає зі збільшенням збільшення. Тому це краще для спостереження за більшими матеріалами зразків.
2. Флуоресцентний мікроскоп із падаючим променем Це новий тип флуоресцентного мікроскопа, розроблений у наш час. На відміну від попереднього, збуджуюче світло падає від лінзи об’єктива до поверхні зразка, використовуючи ту саму лінзу об’єктива як конденсор освітлення та лінзу об’єктива для збору флуоресценції. До оптичного шляху, який знаходиться під кутом 45 градусів до легкого урану, необхідно додати двокольоровий роздільник променя. Світло збудження відбивається в лінзу об'єктива і концентрується на зразку. Флуоресценція, створена зразком, а також світло збудження, відбите від поверхні лінзи об’єктива та покривного скла, одночасно потрапляють в лінзу об’єктива та повертаються до дихроїчного розділювача пучка, розділяючи збудження та флуоресценцію. Потім залишкове збудження поглинається блокуючим фільтром. Якщо використовуються різні комбінації фільтрів збудження/двоколірних сепараторів променів/блокуючих фільтрів, вони можуть задовольнити потреби різних продуктів флуоресцентної реакції. Перевага цього флуоресцентного мікроскопа полягає в тому, що освітлення поля зору рівномірне, зображення чітке, і чим більше збільшення, тим сильніше флуоресценція.
