Принцип і застосування флуоресцентної мікроскопії
(1) Принцип і структурні характеристики флуоресцентного мікроскопа: флуоресцентний мікроскоп використовує точкове джерело світла з високою ефективністю світла для випромінювання світла певної довжини хвилі (наприклад, ультрафіолетове світло 3650 дюймів або фіолетове синє світло 4200 дюймів) через систему фільтрів. як світло збудження для збудження зразка. Після того як флуоресцентна речовина всередині випромінює флуоресценцію різних кольорів, її спостерігають за допомогою збільшення лінзи об’єктива та окуляра. Таким чином, під сильним контрастним фоном, навіть якщо флуоресценція дуже слабка, його легко ідентифікувати та він має високу чутливість. В основному він використовується для дослідження структури та функції клітини та хімічного складу. Основна структура флуоресцентного мікроскопа складається зі звичайного оптичного мікроскопа та деяких аксесуарів (таких як флуоресцентне джерело світла, фільтр збудження, двоколірний світлорозділювач і блокуючий фільтр тощо). Флуоресцентне джерело світла – зазвичай використовують ртутну лампу надвисокого тиску (50-200W), яка може випромінювати світло з різною довжиною хвилі, але кожна флуоресцентна речовина має довжину хвилі збудження, яка створює найсильнішу флуоресценцію, тому необхідно додати фільтр збудження (зазвичай існують ультрафіолетові, фіолетові, сині та зелені фільтри збудження), які пропускають світло збудження лише певної довжини хвилі та опромінюють зразок, поглинаючи інше світло. Після того, як кожна речовина опромінюється збуджуючим світлом, вона випромінює видиму флуоресценцію з довшою довжиною хвилі, ніж довжина хвилі опромінення, за дуже короткий час. Флуоресценція є специфічною і зазвичай слабшою, ніж світло збудження. Для спостереження специфічної флуоресценції необхідний блокуючий (або пригнічуючий) фільтр за лінзою об’єктива. Він має дві функції: одна полягає в поглинанні та блокуванні збуджуючого світла від потрапляння в окуляр, щоб не порушити флуоресценцію та не пошкодити очі; інший — вибрати та пропустити певну флуоресценцію, показуючи певний флуоресцентний колір. Два фільтри слід використовувати разом.
Існує два типи флуоресцентних мікроскопів за оптичним шляхом:
1. Просвічуючий флуоресцентний мікроскоп: джерело збуджуючого світла збуджує флуоресценцію через матеріал зразка через конденсорну лінзу. Зазвичай використовується колектор темного поля, і звичайний колектор також можна використовувати для налаштування дзеркала таким чином, щоб світло збудження проходило та обходило зразок. Це старомодний флуоресцентний мікроскоп. Перевагою є те, що флуоресценція є сильною при малому збільшенні, а недоліком є те, що флуоресценція зменшується зі збільшенням збільшення. Тому це краще для спостереження за більшими матеріалами зразків.
2. Епіфлуоресцентний мікроскоп Це новий тип флуоресцентного мікроскопа, розроблений у наш час. Різниця полягає в тому, що збуджуюче світло падає від лінзи об’єктива на поверхню зразка, тобто одна і та ж лінза об’єктива використовується як освітлювальний конденсор і лінза об’єктива для збору флуоресценції. Дихроїчний дільник променя потрібно додати на шлях світла, який знаходиться на 45 градусів від легкого урану. Світло збудження відбивається в лінзі об'єктива і збирається на зразку. Флуоресценція, створена зразком, і збуджувальне світло, відбите поверхнею лінзи лінзи об’єктива та поверхнею покривного скла, потрапляють в лінзу об’єктива одночасно та повертаються до двоколірного розсіювача променя, щоб зробити збуджувальне світло відокремленим від флуоресценції. , залишкове світло збудження поглинається блокуючими фільтрами. Якщо ви перейдете на комбінацію різних фільтрів збудження/двоколірних світлорозділювачів/блокувальних фільтрів, можна задовольнити потреби в різних продуктах флуоресцентної реакції. Перевага цього типу флуоресцентного мікроскопа полягає в тому, що освітлення поля зору рівномірне, зображення чітке, і чим більше збільшення, тим сильніше флуоресценція.
(2) Як користуватися флуоресцентним мікроскопом.
1. Увімкніть джерело світла, ртутній лампі надвисокого тиску потрібно прогрітися кілька хвилин, щоб досягти найяскравішої точки.
2. Для трансмісійного флуоресцентного мікроскопа необхідний фільтр збудження повинен бути встановлений між джерелом світла та конденсором, а відповідний блокуючий фільтр повинен бути встановлений за лінзою об’єктива. Епіфлуоресцентні мікроскопи повинні вставляти необхідні фільтри збудження/подвійний кольоровий світлорозділювач/блокувальні фільтри в щілини на шляху світла.
3. Спостерігайте за допомогою об’єктива з малим збільшенням і відрегулюйте центр джерела світла відповідно до пристрою налаштування різних типів флуоресцентних мікроскопів так, щоб він знаходився в центрі всієї плями освітлення.
4. Помістіть аркуш із зразком і спостерігайте після фокусування. Слід звернути увагу під час використання: Не дивіться безпосередньо на кінцевий фільтр, щоб не пошкодити очі; при спостереженні препарату масляною лінзою необхідно використовувати спеціальну масляну лінзу без флуоресценції; після вимкнення ртутної лампи високого тиску її не можна відразу ввімкнути знову, її необхідно перевірити. Його можна перезапустити через 5 хвилин, інакше він буде нестабільним і вплине на термін служби ртутної лампи.
(3) Спостереження Використовуючи синьо-фіолетовий світлофільтр під флуоресцентним мікроскопом на навчальній платформі, можна побачити, що клітини, пофарбовані 0,01% акридинового помаранчевого флуоресцентного барвника, ядро та цитоплазма збуджені, щоб виробляти два різні кольори флуоресценція (темно-зелена та оранжево-червона).
