Оптичні властивості біологічних мікроскопів
Оптичні характеристики мікроскопа визначаються такими вісьмома основними оптичними параметрами (або параметрами):
(1) Числова апертура
Числову апертуру також називають дзеркальним коефіцієнтом. Він відноситься до добутку показника заломлення n середовища між об'єктом спостереження та лінзою на значення синуса половини кута лінзи об'єктива. Використовуйте NA або A. для представлення. NA=nsin( /2)
Так званий кут горловини дзеркала відноситься до кута між крайовими променями спостережуваної точки, що входять у передню лінзу об’єктива.
Числова апертура є важливим параметром лінзи об’єктива та збиральної лінзи і тісно пов’язана з іншими оптичними параметрами мікроскопа. Зазвичай сподіваються, що чим більше, тим краще. З формули видно, що є два способи збільшення числової апертури: один — збільшення кута горловини дзеркала, а інший — збільшення показника заломлення між лінзою об’єктива та зразком.
Коли використовується перший метод, зразок і об’єкт можна тримати якомога ближче. Але як би близько не було, завжди менше 180 градусів. Таким чином, sin( /2) також менше 1. Показник заломлення повітря дорівнює n=1. Тому числова апертура nsin(/2) сухої лінзи об’єктива завжди менша за 1, зазвичай між 0.04 і 0.95.
При застосуванні останнього методу між лінзою об’єктива та зразком можна додати середовище з вищим показником заломлення. Наприклад, показник заломлення кедрової олії становить n=1,515. Коли кедрова олія використовується як середовище, числова апертура може досягати більше 1,2. Тому в деяких випадках використовуються масляні окуляри. В даний час максимальна числова апертура, яку може досягти масляна лінза, становить 1,4.
(2) Роздільна здатність
Роздільну здатність також називають рівнем розрізнення або роздільною здатністю. Так звана роздільна здатність відноситься до здатності мікроскопа розрізняти тонку структуру досліджуваного об'єкта. Вона обернено пропорційна відстані роздільної здатності. Роздільна відстань означає мінімальну відстань між двома точками об’єкта, які можна розрізнити. Чим менше роздільна відстань, тим вище роздільна здатність мікроскопа. Якщо відстань між двома точками об’єкта менша за відстань роздільної здатності, дві точки будуть прийняті за одну точку, і її структуру неможливо чітко побачити. Роздільна здатність мікроскопа визначається лінзою об'єктива. Окуляри лише збільшують, а не підвищують роздільну здатність мікроскопа.
У разі нормального центрального освітлення роздільна відстань d лінзи об'єктива визначається наступною формулою.
d=(λ/2)N.A.
У формулі: d означає відстань роздільної здатності, одиниця — мікрон, λ — довжина хвилі світла освітлення, одиниця також — мікрон.
У видимому світлі довжина хвилі з найбільшою яскравістю та найбільшою чутливістю для очей людини становить {{0}}.55 мкм, а максимальна NA лінзи об’єктива становить 1,4. Підставляючи у наведену вище формулу, d дорівнює приблизно 0,2 мкм. Тобто у звичайного оптичного мікроскопа межа відстані роздільної здатності становить 0.2 мкм у разі центрального освітлення. Тобто звичайні оптичні мікроскопи не можуть розрізнити два об’єкти розміром менше 0,2 мкм.
Використовуючи ультрафіолетове світло, можна зменшити довжину хвилі світла освітлення, дозволяючи роздільній відстані досягати 0,1 мкм. Але ультрафіолетові промені неможливо побачити людському оку. Побачити це можна лише після фото.
Довжина хвилі потоку електронів становить лише 0,00387 нм. Використовуючи «електронну лінзу» або магнітну лінзу для керування потоком електронів, роздільна здатність електронного мікроскопа становить до кількох десятих нанометра. З його допомогою можна спостерігати будову атомів.
(3) Збільшення
Збільшення мікроскопа дорівнює добутку збільшення лінзи об'єктива на збільшення окуляра. В принципі, збільшення можна зробити дуже великим. Однак, якщо деталі зразка не можуть бути розпізнані лінзою об’єктива, яким би великим не було збільшення, воно втрачає сенс. Теоретично можна зробити висновок, що найбільш підходяще збільшення мікроскопа (так зване ефективне збільшення, представлене ефективним M) становить від 500 до 1000 чисельної апертури лінзи об’єктива. Тобто 500н.а. Менше або дорівнює M ефективний Менше або дорівнює 1000N.A.
У межах ефективного діапазону збільшення очі можуть спостерігати тривалий час без втоми. Якщо збільшення менше 500 н.а., спостерігати буде важко. Якщо він вищий за 1000N.A., це погіршить якість зображення та навіть призведе до нереального зображення. Тому збільшення понад 1000N.A. називається недійсним збільшенням.
(4) Робоча відстань
Робоча відстань означає відстань між нижньою поверхнею лінзи об’єктива та верхньою поверхнею покривного скла після фокусування мікроскопа за допомогою стандартного покривного скла та стандартної довжини механічної трубки. Чим вище збільшення лінзи об’єктива, тим менша робоча відстань. Загалом, робоча відстань об’єктива з малою потужністю менше 10 разів становить 5-7 мм, тоді як робоча відстань 100-кратного масляного об’єктива становить лише близько 0,19 мм.
(5) Глибина фокусування
При наведенні мікроскопа на певну площину препарату чітко видно не тільки предметну площину, але й одночасно з’єднані з нею верхню та нижню площини предмета. Відстань між верхньою та нижньою площинами предмета називається глибиною фокусу або скорочено глибиною фокусу.
Глибина фокусування мікроскопа дуже мала, і чим більше числова апертура, тим більше загальне збільшення і менше глибина фокусу. Наприклад, при використанні масляної лінзи з NA 1,25/100 разів і 12,5-кратним окуляром для спостереження глибина фокусу становить лише 0,27 мкм. Тобто, після фокусування можна чітко побачити лише тонкий шар товщиною 0,27 мкм. Звичайні зразки зазвичай мають товщину в кілька мікрон. Щоб побачити весь зразок, необхідно використовувати механізм тонкого налаштування мікроскопа для спостереження в шарах зверху вниз.
(6) поле зору
Поле зору також називають полем зору. Відноситься до обсягу досліджуваного об’єкта, який може побачити мікроскоп за один раз. Зазвичай ми хочемо, щоб поле зору було якомога більшим. Поле зору мікроскопа визначається полем зору лінзи об'єктива і полем зору окуляра. Поле зору звичайного об'єктива становить менше 20 мм, а великого може досягати більше 40 мм. Поле зору звичайних 10-кратних окулярів становить 14 мм, а великих може досягати більше 24 мм. Коли об’єктив і окуляр сконструйовані, їх поле зору фіксується. Оскільки поле зору звичайного мікроскопа мало, неможливо побачити весь зразок в одному полі зору, можна побачити лише дуже маленьке коло на зразку. Крім того, розмір поля зору обернено пропорційний повному збільшенню мікроскопа. Чим більше загальне збільшення, тим менше поле зору. Рішення полягає в тому, щоб за допомогою механізму змусити кожну частину зразка по черзі входити в поле зору та спостерігати по черзі.
(7) Яскравість дзеркала
Яскравість дзеркала означає світлість і темність зображення об’єкта, яке видно в мікроскоп. Щоб полегшити спостереження, ми сподіваємося, що отримане зображення буде яскравішим. У разі постійного зовнішнього освітлення яскравість дзеркала пропорційна квадрату числової апертури і обернено пропорційна квадрату повного збільшення. Щоб зображення було яскравішим, слід використовувати об’єктив із великою числовою апертурою з окуляром із малим збільшенням. Наприклад, у випадку того самого об’єктива використання окуляра 5X створить дзеркальне зображення, яке в 4 рази яскравіше, ніж використання окуляра 10X.
Для мікроскопів, що використовують електричні джерела світла, яскравість дзеркального зображення можна контролювати, регулюючи яскравість освітлювача.
(8) Чіткість
Чіткість зображення мікроскопа залежить від його оптичної системи, особливо від оптичних характеристик лінзи об'єктива. Це пов'язано з проектуванням, виробництвом, використанням і зберіганням мікроскопів. Це важливе і складне питання. З точки зору використання та зберігання, основними причинами, які впливають на чіткість, є: товщина покривного скла, що використовується, не відповідає вимогам, фокус не налаштований на ідеальне положення, загальне збільшення занадто велике, а лінза з маслом об'єктив не протертий. Чистий, цвіль на лінзах тощо.
