Технологія багатофотонної мікроскопії: мікроскопія генерації другої гармоніки-з роздільною здатністю поляризації-та її обробка зображень
У нелінійних оптичних мікроскопах для спостереження за ендогенними волокнистими структурами зазвичай використовується генерація другої гармоніки (SHG), і інтенсивність SHG значною мірою залежить від відносного кута між напрямком поляризації падаючого променя та віссю орієнтації молекули-мішені. Таким чином, зображення SHG на основі поляризації (P-SHG) може отримати інформацію про структуру цільових молекул шляхом аналізу функціонального зв’язку між інтенсивністю сигналу SHG та станом поляризації падаючого променя. Зараз він використовується як важливий інструмент для медичного та біологічного аналізу.
Прості зображення SHG можна отримати за допомогою традиційної дво-флуоресцентної мікроскопії з двофотонним збудженням (TPM). Більшість систем TPM все ще використовують метод сканування одним променем на основі рухомого дзеркала, часова роздільна здатність якого залежить від фізичної швидкості руху дзеркала. Щоб досягти швидшого отримання зображень, система TPM також може застосувати метод багатопроменевого сканування (рис. 1A), одним із яких є використання скануючого пристрою обертового диска. Цей блок складається з коаксіального поворотного столика з мікролінзами та поворотного столика з мікрооб’єктивами, причому мікролінзи та отвори на кожному поворотному столику відповідають один--один.
Коли лазер проходить через поворотну платформу мікролінз, хвильовий фронт охоплює кілька мікролінз. Різні мікролінзи фокусують різні частини хвильового фронту в різних положеннях і проходять через відповідні отвори, утворюючи кілька мікропроменів. Ці мікропромені, потрапляючи на зразок, можуть одночасно збуджувати кілька сигналів. Ці сигнали повертаються вздовж системи мікроскопа і знову проходять через отвір і, нарешті, відбиваються дихроїчним дзеркалом між двома поворотними пластинами в пристрій виявлення. Однак титан-сапфіровий лазер із заблокованим режимом-, який зазвичай використовується як джерело світла, має недостатню енергію, що обмежує кількість променів збудження та призводить до малого ефективного поля зору (FOV) для TPM (TPM-SD) за допомогою обертового скануючого пристрою.
Ай Гото та ін. спрямований на отримання високо{1}}швидкісного зображення P-SHG із великим полем зору (FOV) за допомогою системи TPM-SD. Тому в систему TPM-SD було введено лазерне джерело на основі Yb з вищою піковою потужністю.
Це схематична діаграма розробленої ними системи TPM-SD. Джерелом світла системи є лазер на основі Yb, який генерує фемтосекундні імпульси з центральною довжиною хвилі 1042 нм, середньою потужністю 4 Вт, шириною імпульсу 300 фс і частотою повторення 10 МГц. Система спочатку регулює потужність лазера за допомогою напівхвильової пластини та лазерного поляризатора Glan, а потім розширює промінь за допомогою розширювача променя. Розширений промінь вводиться в скануючий блок поворотного столика, а численні мікропромені, що виходять із скануючого блоку, фокусуються на кількох точках зразка через лінзу водяного занурення. Щоб регулювати стан поляризації світлового променя на лінзі об’єктива, на оптичному шляху пучка збудження розміщують напівхвильову та четвертьхвильову пластини.
