Багатофотонна мікроскопія: різноманітні методи візуалізації нейронів in vivo
У порівнянні з традиційним однофотонним широкопольним флуоресцентним мікроскопом багатофотонна мікроскопія (MPM) має функції оптичного розділення та глибокого зображення. У 2019 році Джером Лекок та ін. обговорили відповідну технологію MPM з трьох аспектів: зображення нейронів глибоко в мозку, зображення масивних нейронів і високошвидкісне зображення нейронів.
Для того, щоб зв’язати активність нейронів із складною поведінкою, зазвичай необхідно отримати зображення нейронів у глибокій корі, для чого MPM має здатність глибокого зображення. Світло збудження та випромінювання сильно розсіюється та поглинається біологічною тканиною, що є основним фактором, що обмежує глибину зображення MPM. Хоча проблема розсіювання може бути вирішена шляхом збільшення інтенсивності лазера, це спричинить інші проблеми, такі як спалювання зразка, дефокусування та збудження флуоресцентних ламп біля поверхні. Найкращий спосіб збільшити глибину MPM-зображення – використовувати більш довжину хвилі як світло збудження.
Крім того, для двофотонного (2P) зображення збудження флуоресценції поза фокусом і поблизу поверхні є двома найбільшими факторами, що обмежують глибину, тоді як для трифотонного (3P) зображення ці дві проблеми значно зменшуються, але трифотонне зображення завдяки флуоресценції. Поперечний переріз поглинання групи набагато менший, ніж у 2P, тому для отримання сигналу флуоресценції такої ж інтенсивності, як і збуджуваний 2P, потрібна на порядок вища енергія імпульсу. Функціональна мікроскопія 3P є більш вимогливою, ніж структурна мікроскопія 3P, яка потребує швидшого сканування, щоб вчасно взяти зразки нейронної активності; потрібна вища енергія імпульсу, щоб зібрати достатню кількість сигналів протягом часу перебування кожного пікселя.
Складна поведінка часто включає великі мережі мозку з локальними та далекими зв’язками. Щоб зв'язати активність нейронів з поведінкою, необхідно одночасно спостерігати за активністю дуже великих і широко розповсюджених нейронів. Нейронна мережа в мозку обробляє вхідні стимули протягом десятків мілісекунд. Щоб зрозуміти цю швидку нейронну мережу. Для вивчення динаміки нейронів MPM повинна мати здатність швидко створювати зображення нейронів. Швидкі методи MPM можна розділити на методи однопроменевого сканування та методи багатопроменевого сканування.
Технологія однопроменевого сканування забезпечує високошвидкісне проходження нервової тканини з великим полем зору (FOV)
У разі використання MPM для зображення нейронів сканування з довільним доступом, тобто лазерний промінь швидко сканується в будь-якій вибраній точці в усьому полі зору, може сканувати лише зацікавлені нейрони, що не тільки уникає сканування будь-яких немічених нервових волокон, але й також оптимізують час сканування лазерного променя. Сканування з довільним доступом (рис. 1) може бути досягнуто за допомогою акустооптичного дефлектора (AOD), який працює шляхом приєднання п’єзоелектричного перетворювача з радіочастотним сигналом до відповідного кристала. Результуючі акустичні хвилі створюють решітку з періодичним показником заломлення. Дифракція виникає, коли лазерний промінь проходить через решітку. Інтенсивність і частоту звукової хвилі можна регулювати за допомогою радіочастотного електричного сигналу, щоб змінити інтенсивність і напрямок дифрагованого світла, так що одновимірне горизонтальне довільне точкове сканування може бути реалізовано за допомогою одного AOD, і 3D можна реалізувати за допомогою пари AOD у поєднанні з іншими технологіями осьового сканування сканування з довільним доступом. Однак ця техніка дуже чутлива до руху зразка та схильна до артефактів руху. В даний час швидке растрове сканування, тобто прогресивне сканування в FOV, широко використовується, оскільки алгоритм може легко вирішувати артефакти руху.
Двофотонне зображення неокортикальних нейронів L2/3 in vivo на основі AOD [2]
Існує багато способів реалізувати швидке растрове сканування, використовуючи вібраційне дзеркало для швидкого 2D-сканування, поєднуючи вібраційне дзеркало та регульовану електричну лінзу для швидкого 3D-сканування, але регульована електрична лінза не може швидко сфокусуватися в осьовому напрямку через обмеження Механічне перемикання інерції, яке впливає на швидкість зображення, тепер можна замінити просторовим модулятором світла (SLM).
Дистанційне фокусування також є засобом для отримання 3D-зображення, як показано на малюнку 2. У модулі LSU скануючий гальванометр сканує горизонтально, а модуль ASU включає об’єктив L1 і дзеркало M, а осьове сканування реалізується шляхом регулювання положення M. Ця техніка може не тільки виправити оптичну аберацію, спричинену лінзою головного об’єктива L2, але й забезпечити швидке осьове сканування. Щоб отримати більше зображень нейронів, поле зору можна збільшити, налаштувавши конструкцію об’єктива мікроскопа, але об’єктив із великою NA та великим полем зору зазвичай важкий і не може швидко рухатися для швидкого осьового сканування, тому системи великого поля зору покладаються на телефокус. , SLM і регульовані моторизовані об’єктиви.
Схематична діаграма двофотонної системи візуалізації з дистанційним фокусуванням [3] Технологія багатопроменевого сканування може одночасно знімати зображення різних позицій нейронної тканини
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 мм один від одного) місця візуалізації (рис. 3C, D); для суміжних областей зазвичай використовується кілька променів однієї лінзи об’єктива для зображення (рис. 3E, F). Техніка багатопроменевого сканування повинна приділяти особливу увагу проблемі перехресних перешкод між пучками збудження, яка може бути вирішена методом розділення джерела світла або методом просторово-часового мультиплексування. Метод поділу джерел світла пост-гок стосується використання алгоритмів для розділення променів для усунення перехресних перешкод; метод просторово-часового мультиплексування відноситься до одночасного використання декількох пучків збудження, імпульси кожного променя затримуються в часі, так що окремі пучки, збуджені різними променями, можуть бути тимчасово розділені. флуоресцентний сигнал. Більшу кількість нейронів можна відобразити, ввівши більше пучків, але багатопромені збільшать час згасання флуоресценції, що обмежує здатність розрізняти джерела сигналу; і мультиплексування негативно впливає на швидкість роботи електронних пристроїв. Високі вимоги; велика кількість променів також вимагає більшої потужності лазера для підтримки приблизного співвідношення сигнал/шум одного променя, що може легко призвести до пошкодження тканин.
Технологія зображення великих площ
В останні роки розробка різних технологій MPM розширила сферу нашої візуалізації нервової тканини, дозволяючи нам знімати більше нейронів у глибині мозку з вищою швидкістю, що значно сприяло дослідженням нейронауки та дозволило нам отримати чіткіше розуміння функції мозку.
