Методи збільшення фокусної глибини багатофотонних мікроскопів
Поєднання дво-фотонного лазерного скануючого мікроскопа та кальцієвого індикатора є золотим стандартом для виявлення нейронних сигналів in vivo. Нейрони в нейронних мережах розподілені в три-вимірному просторі, і для моніторингу динаміки їх активності потрібен спосіб швидкого покращення швидкості об’ємного зображення. Однак використання гратчастого скануючого багатофотонного мікроскопа для зображення великої кількості зображень, якщо використовується об’єктив з високою числовою апертурою (NA) для досягнення вищої бокової роздільної здатності, це призведе до меншої фокусної глибини. Щоб отримати об’ємне зображення на малій фокусній глибині,
Необхідно виконати сканування осі Z- певним чином, створюючи зображення багатьох площин шляхом сканування кожної фокальної площини, що значно обмежує швидкість зображення. Якщо можна пожертвувати інформацією про осьове зображення та досягти об’ємного сканування в одному бічному скануванні за рахунок розширення глибини фокусування, тобто об’ємна інформація проектується на одне 2D-зображення, швидкість зображення може бути значно покращена. Це називається розширеною глибиною фокусування (EDF), яка особливо корисна для зображення розріджених популяційних структур, які потребують високої тимчасової роздільної здатності, наприклад для функціонального зображення активності нейронів.
Осьова і бічна роздільна здатність мікроскопа визначаються числовою апертурою (ЧА) лінзи об'єктива. Висока NA може максимізувати осьову та бічну роздільну здатність, а також кількість зібраного світла; Нижча NA призведе до нижчої осьової роздільної здатності, тобто довшої глибини фокусування, але в той же час пожертвує боковою роздільною здатністю та ефективністю збору світла. Метод збільшення глибини фокусу, який буде представлений далі, може досягти цього, зберігаючи високу бокову роздільну здатність і достатній світловий потік.
Використання просторових світлових модуляторів для генерації фокальних тонких пучків Бесселя може отримати EDF зображення, але просторові світлові модулятори є громіздкими, і їх важко сумісти з вузькими просторами мікроскопа; Навпаки, модулі Бесселя на основі осьових пірамід дешеві та компактні, але вони можуть генерувати лише фокусні точки фіксованої глибини і не підходять для різноманітних експериментів, які потребують безперервних змін глибини фокусу. Щоб вирішити цю проблему, у 2018 році RONGWEN LU та ін. продемонстрували модуль Бесселя на основі аксікону, в якому лише одна лінза повинна бути переміщена вздовж оптичної осі, щоб безперервно регулювати осьову довжину фокусної точки Бесселя.
Рисунок 1 (а) Схема пристрою модуля Бесселя; (b) Функція розповсюдження точки була експериментально виміряна, коли D становив -12 мм, 0 мм і 12 мм відповідно; (c) Співвідношення між бічною повною шириною на половині максимуму, (d) аксіальною повною шириною на половині максимуму, (e) піковим сигналом і (f) оптичною силою за лінзою об’єктива зі зміщенням L2 D
Модуль пристрою для формування фокальної точки Бесселя змінної довжини показаний на рисунку 1а. Падаючий гаусівський промінь набуває форму кругового променя після проходження через аксикон і лінзу L1. Подальша кругла апертурна маска може блокувати розсіяне світло, спричинене дефектами аксиконів, таким чином формуючи осьовий розподіл функції розповсюдження точок дво-фотонного збудження. Після цього світловий промінь проектується на гальванометр лінзами L2 і L3, а потім через лінзи L4 і L5 досягає задньої фокальної площини лінзи об'єктива.
Ці конструкції подібні до традиційних модулів на основі пірамід, з тією різницею, що шляхом переміщення L2 або L3 вздовж оптичної осі можна безперервно регулювати осьову довжину фокуса Бесселя. На малюнку 1b показано функції рознесення осьової точки для значень D -12 мм, 0 мм і 12 мм із повною осьовою шириною на половині максимуму 39? м, 24? М і 14? м. Як показано на рисунку 1c-f, переміщення лінзи L2 зліва направо може безперервно змінювати повну ширину на половині максимуму як у поперечному, так і в осьовому напрямках, що означає, що глибину фокусування можна безперервно змінювати. Результати чисельного моделювання на основі векторної теорії дифракції добре узгоджуються з експериментальними даними. На рисунку 2 перевірено вплив корекції різних розмірів кільцевих масок на дефекти аксікону. Виявлено, що більш тонкі кільцеві маски можуть краще оптимізувати осьовий розподіл інтенсивності вихідного пучка Бесселя, але в той же час вони також призводять до більшої втрати потужності.
