Покращено переваги лазерної скануючої багатофотонної мікроскопії
Лазерний скануючий багатофотонний мікроскоп є значним удосконаленням оптичної мікроскопії, головним чином у здатності спостерігати глибоку структуру живих і фіксованих клітин і тканин, а також отримувати чіткі та різкі багатошарові Z-площинні структури, тобто оптичні зрізи, з яких можна побудувати тривимірну суцільну структуру зразка. У конфокальній мікроскопії використовується лазерне джерело світла, яке розширюється, щоб заповнити всю задню фокальну площину лінзи об’єктива, а потім проходить через систему лінз об’єктива, зливаючись у дуже маленькі точки на фокальній площині зразка. Залежно від числової апертури лінзи об’єктива, діаметр точки яскравого освітлення становить близько 0.25 ~ 0.8 мкм, а глибина — приблизно 0.5 ~ 1.5 мкм. Розмір конфокальної точки визначається конструкцією мікроскопа, довжиною хвилі лазера, характеристиками лінзи об’єктива, налаштуванням стану скануючого блоку та природою зразка. Польові мікроскопи мають великий діапазон освітлення та глибину освітлення, тоді як конфокальні мікроскопи концентрують освітлення в одній фокальній точці на фокальній площині. Основною перевагою конфокального мікроскопа є можливість робити тонкі оптичні зрізи товстих флуоресцентних зразків (до 50 мкм або більше) із товщиною зрізів приблизно від 0,5 до 1,5 мкм. Серію зображень оптичного розрізу можна отримати, переміщуючи зразок вгору та вниз за допомогою крокового двигуна мікроскопа по осі Z. Отримання інформації про зображення контролюється в першій площині, і йому не заважають сигнали, що випромінюються з інших місць на зразку. Після усунення ефектів фонової флуоресценції та збільшення співвідношення сигнал/шум контрастність і роздільна здатність конфокального зображення значно покращуються порівняно зі звичайними флуоресцентними зображеннями з польовим освітленням. У багатьох зразках багато складних структурних компонентів переплітаються, утворюючи складні системи, але як тільки вдається отримати достатню кількість оптичних розрізів, ми можемо реконструювати їх у трьох вимірах за допомогою програмного забезпечення. Цей експериментальний метод широко використовувався в біологічних дослідженнях для з’ясування складних структурних і функціональних зв’язків між клітинами або тканинами.
