Лазерна конфокальна мікроскопія - особливості та застосування
Лазерна скануюча конфокальна мікроскопія (LSCM) — це тип мікроскопа, розробленого на основі технології сполученого фокусування, тобто джерело лазерного світла, зразок для вимірювання та детектор знаходяться в сполучених положеннях один з одним.
Фундаментальний
У загальному мікроскопі площина зображення спостереження ізольована від суміжної осьової площини, збігаючи фокальну площину лінзи об’єктива з детектором, тоді як у конфокальному мікроскопі для освітлення зразка використовується світлова пляма, обмежена дифракцією, і A пінхол використовується на шляху зібраного світла в сполученому фокусі світлової плями для фільтрації розсіяного світла для створення цього ефекту ізоляції та, таким чином, покращення роздільної здатності.
Особливості зображення
Зображення сканування оптичного розрізу
Ще одна особливість лазерної скануючої конфокальної мікроскопії полягає в тому, що це технологія скануючого зображення. Традиційна технологія широкого поля освітлення освітлює весь зразок, тому зображення можна отримати безпосередньо неозброєним оком або детектором, але LSCM використовує промінь або кілька сфокусованих променів проходять через зразок для сканування та зображення. Отримане зображення називається оптичним зрізом. Нижче показано різницю між традиційним широкопольним методом освітлення та конфокальним методом лазерного сканування.
Таким чином, фактичний метод роботи сучасного конфокального мікроскопа показаний на малюнку нижче. Збуджувальне світло, випромінюване лазером, проходить через дихроїчне дзеркало і сканується в напрямку x та y зразка через пару гальванометрів. Збудження (або відбиття) зразка — світло потрапляє в детектор ФЕУ через отвір і записується, а записане скановане зображення реконструюється комп’ютером для відновлення фактичного зображення зразка.
Створення зображень "z-стека" на різних фокальних площинах
Лише світло, відбите назад від спряженого шару зразка, може проходити через невеликий отвір на шляху збору світла, а решта нерелевантних відображень шару зразка блокується маленьким отвором. Це може призвести до значного покращення роздільної здатності. Пліч-о-пліч порівняння багатовимірної флуоресцентної мікроскопії та конфокальної мікроскопії однакового товстого зразка. Коли серія зображень робиться в різних фокальних площинах, можуть бути створені зображення, які зазвичай називають «z-стеками», які ілюструють збільшення роздільної здатності та контрастності, які забезпечує конфокальна мікроскопія, а також основні причини цих посилень. Можна побачити, що дослідження зображення у верхній частині стосу з площиною зображення над тканиною виявляє велику кількість розсіяного світла на флуоресцентному зображенні, тоді як зображення конфокальної мікроскопії виглядає чорним. Це зменшення аксіальної PSF безпосередньо призводить до різниці в роздільній здатності, що спостерігається на оптичному інтерфейсі в середині z-стоку.
Роздільна здатність значно покращена порівняно з широкоформатним освітленням
У флуоресцентній мікроскопії інтенсивність світла, що випромінюється з однієї точки, описується функцією розповсюдження точки (PSF), а її візерунок є диском Ейрі. Роздільна здатність флуоресцентної системи може бути описана радіусом диска Ейрі, який можна описати так: Числова апертура лінзи об’єктива та довжина хвилі збуджуючого світла визначають
