Особливості та застосування лазерного конфокального мікроскопа
У той час як у звичайному мікроскопі площина зображення для спостереження ізольована від сусідніх осьових площин шляхом перекриття фокальної площини лінзи об’єктива з детектором, у конфокальному мікроскопі ця ізоляція досягається освітленням зразка з точкою, обмеженою дифракцією. світло та фільтрація розсіяного світла за допомогою отвору на шляху зібраного світла у сполученому фокусі цієї точки світла для досягнення цієї ізоляції та, таким чином, покращення роздільної здатності.
Лише світло, відбите назад від шару сполученого зразка, може проходити через отвір на шляху збору світла, тоді як решта нерелевантних відображень шару зразка блокується отвором. Це дає значне збільшення роздільної здатності. Нижче наведено паралельне порівняння багатовимірної флуоресцентної мікроскопії та конфокальної мікроскопії однакового товстого зразка. Коли серія зображень робиться в різних фокальних площинах, створюється зображення, яке зазвичай називають «z-стеком», яке показує посилення роздільної здатності та контрастності, отримані конфокальною мікроскопією, і основні причини цих посилень. Можна побачити, що дослідження зображення у верхній частині стопки, де площина зображення знаходиться над тканиною, виявляє велику кількість розсіяного світла на флуоресцентному зображенні, тоді як зображення конфокального мікроскопа виглядає чорним. Це зменшення PSF в аксіальному напрямку безпосередньо впливає на різницю в роздільній здатності, що спостерігається на оптичному інтерфейсі в середині z-стоку.
Зображення оптичного сканування зрізів
Ще одна особливість лазерної скануючої конфокальної мікроскопії полягає в тому, що це метод сканування. Традиційні методи освітлення широкого поля освітлюють весь зразок, щоб зображення можна було отримати безпосередньо неозброєним оком або детектором, але LSCM використовує один або кілька сфокусованих променів світла для сканування зразка, тому отримане зображення називається оптичний зріз, як показано на наступній схемі. Різниця між традиційним широкопольним освітленням і лазерним скануючим конфокальним освітленням показана нижче.
Тому практичний спосіб сучасної конфокальної мікроскопії показаний на малюнку нижче. Збуджувальне світло від лазера пропускається через дихроїчне дзеркало та сканується через пару дзеркал гальванометра в напрямку x та y зразка, а збудження (або відображення) зразка проходить через отвір у ФЕУ. детектор для запису, а записане скановане зображення реконструюється комп’ютером для створення фактичного зображення зразка.
