Знання конфокального флуоресцентного мікроскопа
Основний принцип конфокальної флуоресцентної мікроскопії: точкове джерело світла використовується для опромінення зразка, утворюючи невелику, чітко визначену світлову точку на фокальній площині; Флуоресценція, що випромінюється з цієї точки після опромінення, збирається лінзою об’єктива та повертається вздовж вихідного шляху світла випромінювання до світлорозділювача, що складається з двонаправленого хроматичного дзеркала. Розділювач променя направляє флуоресценцію безпосередньо на детектор. Як джерело світла, так і детектор мають отвір перед собою, який називається отвором освітлення та отвором виявлення відповідно. Обидві мають однакову геометрію, приблизно 100-200 нм, і спряжені щодо точки світла на фокальній площині, тобто точка світла проходить через низку лінз і в кінцевому підсумку може бути сфокусована на обох освітлювальних і отвори детектора. Таким чином, світло з фокальної площини може сходитися всередині отвору зонда, тоді як розсіяне світло згори або під фокальною площиною блокується за межами апертури зонда, і його неможливо відобразити. Лазер сканує зразок точка за точкою, а фотопомножувач після виявлення отвору також отримує конфокальне зображення відповідної світлової точки точка за точкою, яке перетворюється на цифровий сигнал і передається на комп’ютер, і, нарешті, збирається в чітке зображення. конфокальне зображення всієї фокальної площини на екрані.
Кожне зображення у фокальній площині насправді є оптичним перерізом зразка, і цей оптичний переріз завжди має певну товщину, також відомий як оптичний лист. Оскільки інтенсивність світла в фокальній точці набагато більша, ніж у нефокальній точці, а світло нефокальної площини відфільтровується отвором, глибина різкості конфокальної системи наближається до нуля, а сканування вздовж напрямку осі Z дозволяє оптичній томографії сформувати двовимірний оптичний зріз зразка для спостереження у фокальній плямі. Поєднуючи сканування площини XY (фокальної площини) зі скануванням осі Z (оптичної осі), можна отримати тривимірне зображення зразка шляхом накопичення послідовних шарів двовимірних зображень, які обробляються спеціальним комп’ютерним програмним забезпеченням.
Це означає, що отвір виявлення та отвір джерела світла завжди сфокусовані в одній точці, тому флуоресценція, що збуджується поза фокальною площиною, не може потрапити в отвір виявлення.
Принцип роботи конфокального лазера просто виражається в тому, що він використовує лазер як джерело світла на основі традиційного флуоресцентного мікроскопічного зображення, додаткового лазерного скануючого пристрою та сполученого фокусуючого пристрою за допомогою комп’ютерного керування для отримання цифрових зображень та системи обробки.
