Як багато ви знаєте про флуоресцентну мікроскопію
Флуоресцентні мікроскопи зазвичай використовують ртутні лампи високої інтенсивності як джерела збудження світла. Фільтри використовуються для фільтрації небажаного світла, залишаючи лише чисте світло високої інтенсивності, яке збуджує флуорофор. Після того, як монохроматичне світло опромінює зразок через лінзу об’єктива, зразок буде збуджено випромінювати світло (флуоресценцію), і як флуоресценція, так і світло збудження повертатимуться вздовж оптичного шляху лінзи об’єктива. У цьому випадку потрібне дихроїчне дзеркало для фільтрації збуджуючого світла. , пропускаючи лише потрібну нам флуоресценцію.
Ця флуоресценція досягає окуляра вздовж світлового шляху мікроскопа, а потім потрапляє в наші очі, де ми можемо побачити флуоресценцію, випромінювану флуорофором.
Попередня перевірка та налаштування флуоресцентного мікроскопа:
(1) Перед кожним спостереженням флуоресценції необхідно регулярно перевіряти вирівнювання нитки розжарювання, фокус оптичного шляху, апертурну діафрагму та параметри польової діафрагми флуоресцентного пристрою.
(2) Чи встановлено в конвертор необхідний вузол збудження/випромінювання флуоресценції, чи правильно налаштовано об’єктив флуоресцентного мікроскопа та видаліть масляні плями та пил на передній лінзі об’єктива.
(3) Якщо одночасно проводиться спостереження фазового контрасту прохідного світла, необхідно перевірити сполучення центру конденсора та кільця фазового контрасту навпроти лінзи об’єктива.
(4) Перевірте, чи носій зразка (предметне скло, покривне скло та інший посуд) не покритий рідиною або пилом, і чи товщина знаходиться в межах відкаліброваного діапазону робочої відстані лінзи об’єктива. Нарізаний зразок не повинен бути надто товстим, бажано менше або дорівнювати 10 мкм.
(5) Оскільки джерело освітлення містить ультрафіолетові промені, коричнева світлозахисна пластина розміщена над передньою частиною столика, щоб запобігти пошкодженню ультрафіолетовими променями сітківки.
(6) Нестабільність напруги зменшить термін служби ртутної лампи високого тиску, а джерело живлення джерела світла оснащене стабілізатором напруги.
(7) Щоб продовжити термін служби ртутної лампи, її можна вимкнути через 15 хвилин після ввімкнення; після вимкнення люмінесцентної лампи потрібно почекати принаймні 10 хвилин, щоб пари ртуті знову охолонули та повернулися до початкового стану, інакше термін служби лампи буде скорочений.
Спостереження зображення за допомогою флуоресцентного мікроскопа:
(1) Приблизно через 5-10 хвилин після ввімкнення флуоресцентного джерела світла інтенсивність збуджуючого світла має тенденцію бути стабільною, і зразок завантажується для спостереження; щоб запобігти погашенню флуоресценції зразка, спричиненому надмірним світлом збудження під час фокусування та пошуку об’єктів, спочатку зменште масштаб флуоресцентного мікроскопа. Налаштуйте світло збудження до помірної інтенсивності за допомогою апертурної діафрагми або додайте фільтр ND, і регулярно переміщайте столик для зразків. Після підтвердження дзеркального відображення налаштуйте флуоресцентний стан для зйомки та запису.
(2) Коригування низької якості зображення. Окрім факторів підготовки зразка, можна внести необхідні коригування:
① Виключіть світлозахисні або світлообмежуючі пристрої на оптичному шляху зображення, такі як аксесуари DIC, фільтри ND тощо.
②Відрегулюйте фокус приймача та розмір діафрагми апертури флуоресцентного мікроскопа.
③ Обережно відрегулюйте кільце корекції різниці охоплення об’єктива флуоресцентного мікроскопа.
Точки застосування флуоресцентної мікроскопії
Флуоресцентна мікроскопія використовує зображення "актинічної флуоресценції". Якщо вибрана довжина хвилі збудження знаходиться в ближньому ультрафіолетовому діапазоні (320-400 нм), який невидимий неозброєним оком, спектр випромінювання флуоресценції також коротший, ніж середня довжина хвилі звичайних світлових дзеркальних джерел світла. покращити. Фотони високої енергії стикаються з електронами, викликаючи перехід електронів з основного стану в збуджений. Електрони в збудженому стані дуже нестабільні і повертаються в основний стан. У цьому процесі буде споживатися частина теплової енергії і випромінюватися нові фотони. Новий фотон має нижчу енергію, ніж вихідний фотон, і тому має більшу довжину хвилі. Оскільки довжина хвилі нового фотона відрізняється від довжини хвилі фотона падаючого світла, два пучки світла з різними довжинами хвиль розділяються за допомогою певного методу оптичної обробки, так що ми бачимо лише випущені нові фотони (сигнал флуоресценції), тобто флуоресцентний мікроскоп бачить флуоресцентні зображення.
