Чим флуоресцентна мікроскопія відрізняється від звичайної мікроскопії
Нещодавно я спробував зробити кілька заморожених зрізів мишей, і тепер мені потрібно використати флуоресцентний мікроскоп, щоб побачити, чи введений мною вірус знаходиться в потрібній області мозку. Необхідно коротко вивчити деякі основні принципи флуоресцентної мікроскопії, і я також поділюся ними тут.
Флуоресцентний мікроскоп використовує ультрафіолетове світло як джерело світла для освітлення досліджуваного об’єкта, змушуючи об’єкт випромінювати джерело світла, а потім спостерігати за об’єктом під мікроскопом. В основному використовується для імунофлуоресцентних клітин, він складається з джерела світла, системи фільтрів та оптичної системи для спостереження за флуоресцентним зображенням зразка через збільшення окуляра та лінзи об’єктива. Давайте розглянемо різницю між цим флуоресцентним мікроскопом і звичайним оптичним мікроскопом.
1. За способами освітлення
У методі освітлення флуоресцентного мікроскопа зазвичай використовується метод падаючого променя, що означає, що джерело світла проектується на тестовий зразок через лінзу об’єктива.
2. За роздільною здатністю
Флуоресцентна мікроскопія використовує ультрафіолетове світло як джерело світла з відносно короткою довжиною хвилі, але вищою роздільною здатністю, ніж у звичайних оптичних мікроскопів.
3. Відмінності на фільтрі
Флуоресцентний мікроскоп використовує два спеціальні фільтри: один перед джерелом світла для фільтрації видимого світла, а інший між об’єктивом і окуляром для фільтрації ультрафіолетового світла, яке може захистити очі.
Флуоресцентна мікроскопія також є різновидом оптичного мікроскопа, головним чином тому, що довжина хвилі, яку збуджує флуоресцентна мікроскопія, коротка, що призводить до відмінностей у структурі та використанні флуоресцентної мікроскопії та звичайної мікроскопії. Більшість флуоресцентних мікроскопів добре вловлюють слабке світло, тому їхня здатність відображати зображення також є хорошою за надзвичайно слабкої флуоресценції. Крім того, з безперервним удосконаленням флуоресцентної мікроскопії в останні роки рівень шуму також значно зменшився. Тому все більше і більше застосовуються флуоресцентні мікроскопи.
Знання, пов'язані з двофотонною флуоресцентною мікроскопією
Основний принцип двофотонного збудження полягає в тому, що при високій щільності фотонів флуоресцентні молекули можуть одночасно поглинати два довгохвильові фотони, а після короткого періоду так званого часу життя збудженого стану випромінювати фотон з меншою довжиною хвилі; Його ефект такий самий, як використання фотона з довжиною хвилі вдвічі меншою для збудження флуоресцентних молекул. Двофотонне збудження вимагає високої щільності фотонів, і щоб уникнути пошкодження клітин, у двофотонному мікроскопі використовується високоенергетичний імпульсний лазер із синхронізованим режимом. Лазер, випромінюваний цим типом лазера, має високу пікову енергію та низьку середню енергію з шириною імпульсу лише 100 фемтосекунд і частотою до 80–100 мегагерц. При використанні об’єктива з високою числовою апертурою для фокусування фотонів імпульсного лазера щільність фотонів у фокальній точці об’єктива є найвищою, а двофотонне збудження виникає лише в фокальній точці об’єктива. Тому для двофотонного мікроскопа не потрібні конфокальні отвори, що підвищує ефективність детектування флуоресценції.
У загальних явищах флуоресценції через низьку щільність фотонів збудження флуоресцентна молекула може поглинати лише один фотон одночасно, а потім випромінювати один флуоресцентний фотон через перехід випромінювання, який називається однофотонною флуоресценцією. У процесі збудження флуоресценції з використанням лазера як джерела світла можуть виникнути явища двофотонної або навіть багатофотонної флуоресценції. У цей час використовується джерело збудження світла високої інтенсивності, а щільність фотонів відповідає вимогам, щоб флуоресцентні молекули поглинали два фотони одночасно. У процесі використання типового лазера як джерела світла збудження щільність фотонів все ще недостатня для генерації явища двофотонного поглинання. Як правило, використовуються фемтосекундні імпульсні лазери, миттєва потужність яких досягає рівня мегават. Таким чином, довжина хвилі двофотонної флуоресценції коротша, ніж хвиля збудження, що еквівалентно ефекту збудження половинної довжини хвилі збудження.
