Як правильно вибрати конфокальний мікроскоп? Чи є якийсь конкретний метод?
Конфокальна мікроскопія має більше переваг, ніж широкопольна мікроскопія. Конфокальна мікроскопія може виконувати безперервний оптичний розріз зразків і виключати перешкоди сигналу від нефокальних площин. З цієї причини застосування конфокальної мікроскопії справді більш поширене. Однак конфокальних мікроскопів на ринку стає все більше. Як вибрати?
Конфокальна мікроскопія має більше переваг, ніж широкопольна мікроскопія. Конфокальна мікроскопія дозволяє робити безперервні оптичні зрізи зразків і виключати перешкоди сигналу від нефокальних площин. З цієї причини конфокальна мікроскопія справді більш поширена. Однак конфокальних мікроскопів на ринку стає все більше. Як вибрати? При виборі конфокального мікроскопа враховуйте два основних і важливих аспекти: тип зразка, який ви хочете дослідити (наприклад, фіксовані або живі клітини), і тип аналізу, який ви хочете виконати (наприклад, статичні або динамічні клітинні процеси).
Конфокальне зображення фіксованих клітин
Для зображення фіксованих і пофарбованих клітин або тканин ми зазвичай обираємо конфокальне лазерне сканування (LSCM). Це головним чином тому, що фіксовані мертві клітини не мають швидких біологічних подій у живих клітинах, і вони можуть краще отримати вигоду від вищої просторової роздільної здатності LSCM. Зображення LSCM полягає в оптичному розрізанні зразка лазером, а швидкість сканування (залежно від швидкості дзеркала скануючої матриці) зазвичай становить 1 кадр/с. Довший час експозиції означає більший ризик фотовідбілювання, але для фіксованих мертвих клітин час не є критичним, і ми можемо усереднити його, зробивши кілька знімків.
Конфокальне зображення живих клітин
Зображення живих клітин вимагає додаткового захисту від несприятливого середовища. Під час візуалізації ми в першу чергу дбаємо про збереження життєздатності та здоров’я клітин. Нагрівальні елементи постійної температури та системи перфузії є важливими, особливо для сповільнених досліджень. Більшість людей хочуть вивчати швидкі біохімічні події, які контролюють фізіологічний стан живих клітин, але ці події надто швидкі для звичайної LSCM. Крім того, тривалий вплив LSCM також викликав токсичне світлове пошкодження клітин. Тому для зображення живих клітин потрібні спеціальні конфокальні мікроскопи.
Загалом існує два варіанти конфокального зображення живих клітин: конфокальні скануючі скануючі лазери зі швидким скануванням і конфокальні скануючі обертові диски. Швидка скануюча конфокальна мікроскопія замінює повільніші дзеркала гальванометрів швидшими резонансними скануючими дзеркалами, що забезпечує швидкість сканування до 30 кадрів в секунду; у той час як конфокальні обертові диски (SDCM) мають перевагу швидшого сканування (хоча неминуче з втратою просторової роздільної здатності), його швидкість теоретично може досягати 2000 кадрів в секунду (на практиці вона часто обмежена іншими факторами).
Якщо ви стурбовані фотовідбілюванням або дуже слабким сигналом флуоресценції, SDCM може бути більш придатним. SDCM використовує два диски, що обертаються, із мікролунками для розсіювання збуджуючого світла. На відміну від LSCM, який сканує пляму зразка, SDCM отримує кілька плям одночасно (приблизно 100 піксельних плям), тому швидкість значно збільшується, а фотознебарвлення SDCM і менша фототоксичність. Однак ви також можете використовувати конфокальні пристрої зі швидким скануванням, щоб збільшити швидкість сканування в поєднанні з високочутливими детекторами та зменшити енергію збудження світла для зменшення фототоксичності, що може зберегти багаті функції традиційних конфокальних зображень.
Автоматизована конфокальна система візуалізації
Деяким дослідникам подобається шукати способи модифікувати мікроскоп відповідно до своїх індивідуальних потреб. А деякі дослідники навіть не цікавляться, як насправді працюють мікроскопи. Останнім може більше сподобатися автоматизований конфокальний мікроскоп. Наприклад, Olympus FluoViewFV10i — це такий повністю автоматичний настільний 4-лазерний конфокальний мікроскоп. Його компактна інтегрована структура майже не потребує місця для встановлення. Цей тип інструментів ідеально підходить для дослідників, яким потрібно щодня отримувати багато даних про зображення, але, звичайно, вони не повністю відображають функціональність і гнучкість традиційних конфокальних об’єктів. Крім того, NikonA1 також є повністю автоматичною конфокальною системою. Як і більшість звичайних конфокальних скануючих мікроскопів, NikonA1 використовує скануючу головку гальванометра, яка має вищу роздільну здатність, ніж A1R із гібридною скануючою головкою, але трохи нижчу швидкість (A1R ~30 кадрів/с).
