Флуоресцентна мікроскопія відрізняється від звичайної мікроскопії
Флуоресцентні мікроскопи використовують ультрафіолетове світло як джерело світла для опромінення досліджуваного об’єкта, щоб об’єкт випромінював світло, а потім спостерігав за об’єктом під мікроскопом. В основному використовується для імунофлюоресцентних клітин. В основному він складається з джерела світла, системи фільтрів та оптичної системи для спостереження за флуоресцентним зображенням зразка через збільшення окуляра та лінзи об’єктива. Давайте розглянемо різницю між цим флуоресцентним мікроскопом і звичайним оптичним мікроскопом.
1. Подивіться на метод освітлення
Метод освітлення флуоресцентного мікроскопа, як правило, епіскопічний, тобто джерело світла проектується на досліджуваний зразок через лінзу об’єктива.
2. Подивіться на дозвіл
Флуоресцентні мікроскопи використовують ультрафіолетове світло як джерело світла, і довжина хвилі відносно коротка, але роздільна здатність вища, ніж у звичайних оптичних мікроскопів.
3. Різниця в фільтрі
У флуоресцентних мікроскопах використовуються два спеціальні фільтри, які використовуються перед джерелом світла, щоб фільтрувати видиме світло, і використовуються між об’єктивом і окуляром, щоб фільтрувати ультрафіолетові промені, які можуть захистити очі людини.
Флуоресцентний мікроскоп також є різновидом оптичного мікроскопа, головним чином тому, що довжина хвилі, збуджена флуоресцентним мікроскопом, коротка, тому це призводить до різниці в структурі та використанні між флуоресцентним мікроскопом і звичайним мікроскопом. Більшість флуоресцентних мікроскопів добре вловлюють слабке світло, тому за надзвичайно слабкої флуоресценції їх здатність до зображення також хороша. У поєднанні з безперервним удосконаленням флуоресцентних мікроскопів за останні роки рівень шуму також значно зменшився. Тому все частіше використовують флуоресцентні мікроскопи.
пара
Знання про фотонну флуоресцентну мікроскопію
Основний принцип двофотонного збудження такий: у разі високої щільності фотонів флуоресцентні молекули можуть поглинати два довгохвильові фотони одночасно та випромінювати короткохвильовий фотон після короткого так званого часу існування збудженого стану; ефект такий самий, як використання фотона з довжиною хвилі, яка вдвічі менша за довгохвильову, для збудження флуоресцентних молекул. Для двофотонного збудження потрібна висока щільність фотонів. Щоб не пошкодити клітини, у двофотонній мікроскопії використовуються високоенергетичні імпульсні лазери з синхронізованим режимом. Лазер, випромінюваний цим лазером, має високу пікову енергію та низьку середню енергію, ширина його імпульсу становить лише 100 фемтосекунд, а його частота може досягати 80-100 мегагерц. При використанні об’єктива з високою числовою апертурою для фокусування фотонів імпульсного лазера щільність фотонів у фокальній точці лінзи об’єктива є найвищою, а двофотонне збудження виникає лише в фокальній точці лінзи об’єктива, тому двофотонний мікроскоп не потребує конфокального отвору, що покращує ефективність детектування флуоресценції.
У загальних явищах флуоресценції через низьку щільність фотонів збуджуючого світла флуоресцентна молекула може поглинати лише один фотон одночасно, а потім випускати флуоресцентний фотон через радіаційний перехід, який є однофотонною флуоресценцією. Для процесу збудження флуоресценції з використанням лазера як джерела світла може виникнути двофотонна або навіть багатофотонна флуоресценція. У цей час інтенсивність джерела збудження, що використовується, висока, а щільність фотонів відповідає вимогам флуоресцентних молекул, які поглинають два фотони одночасно. У процесі використання загального лазера як джерела світла збудження щільність фотонів все ще недостатня для виникнення явища двофотонного поглинання. Зазвичай використовується фемтосекундний імпульсний лазер, миттєва потужність якого може досягати порядку мегават. Тому довжина хвилі двофотонної флуоресценції коротша за довжину хвилі збуджуючого світла, що еквівалентно ефекту збудження на половині довжини хвилі збудження.
Двофотонна флуоресцентна мікроскопія має багато переваг:
1) Довгохвильове світло менше піддається розсіюванню, ніж короткохвильове світло, і легко проникає через зразок;
2) Флуоресцентні молекули поза фокальною площиною не збуджуються, так що більше збуджуючого світла може досягати фокальної площини, так що збуджуюче світло може проникати глибше в зразки;
3) Довгохвильове ближнє інфрачервоне світло менш токсичне для клітин, ніж короткохвильове світло;
4) При використанні двофотонного мікроскопа для спостереження за зразками фотознебарвлення та фототоксичність виникають лише у фокальній площині. Таким чином, двофотонна мікроскопія більше підходить, ніж однофотонна мікроскопія, для спостереження за товстими зразками, для спостереження за живими клітинами або для експериментів з точковим фотовідбілюванням.
Знання конфокальної флуоресцентної мікроскопії
Основний принцип конфокальної флуоресцентної мікроскопії: зразок опромінюється точковим джерелом світла, і на фокальній площині утворюється невелика чітка світлова пляма. Після того, як точка опромінюється, випромінювана флуоресценція збирається лінзою об’єктива та повертається до світлорозділювача, що складається з дихроїчного дзеркала вздовж вихідного шляху освітлення. Розділювач променя направляє флуоресценцію безпосередньо на детектор. Перед джерелом світла та детектором є отвір-точка, яка відповідно називається точкою освітлення та точкою виявлення. Геометричний розмір обох є однаковим, близько 100-200 нм; по відношенню до світлової плями на фокальній площині, ці дві точки є сполученими, тобто світлова пляма проходить через низку лінз і, нарешті, може бути сфокусована на точці освітлення та точці виявлення одночасно. Таким чином, світло з фокальної площини може зводитися в межах отвору виявлення, тоді як розсіяне світло зверху або під фокальною площиною блокується за межами отвору виявлення і не може бути зображено. Лазер сканує зразок точка за точкою, а фотопомножувач після виявлення отвору також отримує конфокальне зображення відповідної світлової точки точка за точкою, яке перетворюється на цифровий сигнал і передається на комп’ютер, а потім агрегується в чітке зображення. конфокальне зображення всієї фокальної площини на екрані.
Кожне зображення у фокальній площині насправді є оптичним поперечним перерізом зразка, і цей оптичний переріз завжди має певну товщину, також відому як оптичний тонкий зріз. Оскільки інтенсивність світла в фокальній точці набагато більша, ніж у нефокусній точці, а світло нефокальної площини відфільтровується отвором, глибина різкості конфокальної системи приблизно дорівнює нулю, а сканування вздовж Вісь Z може реалізувати оптичну томографію, утворюючи двовимірний оптичний зріз у сфокусованій точці зразка, який потрібно спостерігати. Поєднуючи сканування площини XY (фокальної площини) зі скануванням осі Z (оптичної осі), тривимірне зображення зразка може бути отримано шляхом накопичення двовимірних зображень безперервних шарів і оброблених спеціальним комп’ютерним програмним забезпеченням.
Тобто отвір виявлення та отвір джерела світла завжди сфокусовані в одній точці, тому флуоресценція, збуджена за межами фокальної площини, не може потрапити в отвір виявлення.
Просте вираження принципу роботи конфокального лазера полягає в тому, що він використовує лазерне світло як джерело світла. На основі традиційної флуоресцентної мікроскопічної візуалізації він додає лазерний скануючий пристрій і сполучений фокусуючий пристрій, і це система для отримання та обробки цифрових зображень за допомогою комп’ютерного керування.
