Особливості та застосування конфокальної лазерної мікроскопії
Лазерний скануючий конфокальний мікроскоп (LSCM) — це тип мікроскопа, розробленого на основі технології сполученого фокусування, тобто для того, щоб джерело лазерного світла, досліджуваний зразок і детектор перебували в сполученому положенні один одного.
Фундаментальний
У звичайних мікроскопах фокальна площина лінзи об’єктива збігається з детектором, так що площина спостережуваного зображення ізольована від сусідньої осьової площини, тоді як у конфокальних мікроскопах зразок освітлюється за допомогою дифракційно обмеженої світлової плями, а в Цей ефект ізоляції досягається за допомогою отвору на шляху збору світла в фокальній точці кон’югату плями для фільтрації розсіяного світла для покращення роздільної здатності.
Функції візуалізації
Лише світло, відбите назад від спряженого шару зразка, може проходити крізь маленький отвір на шляху збору світла, а інші нерелевантні відбиття шару зразка блокуються маленьким отвором. Це може призвести до значного збільшення роздільної здатності. Нижче наведено паралельне порівняння багатовимірної флуоресцентної мікроскопії та конфокальної мікроскопії однакового товстого зразка. Коли серія зображень робиться в різних фокальних площинах, може бути створено те, що зазвичай називають «z-стіком», і це зображення показує як роздільну здатність, так і збільшення контрастності, що забезпечується конфокальною мікроскопією, а також основні причини цих посилень. Перегляд зображення у верхній частині стека з площиною зображення над тканиною виявляє багато розсіяного світла на флуоресцентному зображенні, тоді як конфокальне зображення виглядає чорним. Це зменшення PSF в аксіальному напрямку безпосередньо відповідає за різницю в роздільній здатності, що спостерігається на оптичному інтерфейсі в середині z-стоку.
Ще одна особливість лазерної скануючої конфокальної мікроскопії полягає в тому, що це технологія скануючого зображення. Традиційна технологія широкого поля освітлення освітлює весь зразок, тому зображення може бути безпосередньо захоплене неозброєним оком або детектором, але LSCM використовує промінь або кілька сфокусованих променів проходять через зразок для сканування та зображення, і отримане зображення є називають оптичною секцією. Нижче показано різницю між традиційним широкопольним методом освітлення та конфокальним методом лазерного сканування.
Тому практичний метод роботи сучасного конфокального мікроскопа показаний на малюнку нижче. Збуджувальне світло, випромінюване лазером, проходить через дихроїчне дзеркало та сканує в напрямках x і y зразка через пару вібруючих дзеркал. Збудження (або відображення) зразка Світло потрапляє в детектор ФЕУ через отвір і записується, а записане скановане зображення реконструюється комп’ютером для отримання фактичного зображення зразка.
