Відмінності, переваги та недоліки між трансмісійною флуоресцентною мікроскопією та відбивною флуоресцентною мікроскопією
1. Трансмісійний флуоресцентний мікроскоп: джерело збудження світла пропускається через матеріал зразка через конденсор для збудження флуоресценції. Концентратори темного поля, які зазвичай використовуються, або звичайні концентратори можна використовувати для налаштування рефлектора для перетворення збуджуючого та бічного світла на зразок. Це відносно старомодний флуоресцентний мікроскоп. Його перевагою є сильна флуоресценція при малому збільшенні, а недоліком є те, що його флуоресценція слабшає зі збільшенням збільшення. Тому це краще для спостереження за більшими матеріалами зразків.
2. Флуоресцентний мікроскоп з падаючим променем: це новий тип флуоресцентного мікроскопа, який розвинувся в наш час. На відміну від попереднього, збуджуюче світло падає з лінзи об’єктива на поверхню зразка, використовуючи ту саму лінзу об’єктива як конденсор освітлення та лінзу об’єктива для збору флуоресценції. До оптичного шляху необхідно додати двокольоровий роздільник променя, який утворює кут 45 градусів з фотоураном. Збуджувальне світло відбивається в об'єктив і збирається на зразку. Флуоресценція, створена зразком, і світло збудження, відбите від поверхні лінзи об’єктива та покривного скла, одночасно потрапляють в лінзу об’єктива та повертаються до двоколірного розділювача променя, розділяючи світло збудження та флуоресценцію. Потім залишкове світло збудження поглинається блокуючим фільтром. Якщо використовуються різні комбінації фільтрів збудження, двокольорових сепараторів пучка та блокуючих фільтрів, вони можуть задовольнити потреби різних флуоресцентних продуктів реакції. Перевагами цього флуоресцентного мікроскопа є рівномірне освітлення поля зору, чітке зображення та сильніша флуоресценція з більшим збільшенням.
Переваги та недоліки трансмісійної флуоресцентної мікроскопії
Джерело світла: ртутна лампа високого тиску або галогенна лампа.
Прожекторне дзеркало: використання прожектора темного поля для розділення збудження та флуоресценції.
Об’єктив: можна використовувати будь-який тип об’єктива.
Зразок: Тонкі зразки більше підходять для спостереження за передачею.
Переваги: ① Завдяки використанню конденсора темного поля збуджувальне світло не може потрапити в лінзу об’єктива, що полегшує формування темного фону та досягнення хорошого контрасту, а для спостереження можна використовувати будь-який об’єктив. ② При використанні об’єктива з низьким збільшенням він яскравіший, ніж відбивний флуоресцентний мікроскоп.
Недолік: центр і висоту прожектора необхідно правильно відрегулювати, інакше неможливо отримати яскраве флуоресцентне зображення. Через обмеження фокусної відстані прожектора темного поля не можна використовувати товсті предметні скла. Площа освітлення поля зору не повинна бути надто великою, інакше колір флуоресценції флуоресцентного зразка може згаснути. Товсті або непрозорі зразки не підходять.
Переваги та недоліки відбивної флуоресцентної мікроскопії
Джерело світла: ртутна лампа високого тиску або галогенна лампа.
Фокусуюча лінза: оскільки об’єктив служить фокусуючою лінзою, у фокусній лінзі немає потреби.
Лінза об’єктива: Лінза об’єктива, що використовується, повинна пропускати достатню кількість ультрафіолетового світла і сама по собі не виробляти флуоресценцію, без обмеження числової апертури.
Зразок: можна спостерігати як товсті, так і непрозорі зразки.
Переваги: ① Оскільки лінза об’єктива також служить прожектором, вона не вимагає особливого налаштування. ② За допомогою методу освітлення Kolar можна використовувати ефекти діафрагми та діафрагми поля зору. Числова апертура лінзи об’єктива не обмежена, і зображення з високою роздільною здатністю також можна отримати при великому збільшенні. Також можна використовувати товсті або непрозорі зразки. спостерігаються, а також можна використовувати товсті покривні скла. Інші методи спостереження також можна поєднувати з відбитою флуоресценцією, особливо з методом різниці фаз і методом диференціальної інтерференції пропускання. Це може уникнути непотрібного явища вицвітання кольору флуоресценції.
Недолік: при використанні наземного збільшувального об’єктива зображення виходить відносно темним, тому слід використовувати об’єктив із високою числовою апертурою. Система фільтрів повинна ефективно розділяти люмінесценцію збудження та флуоресценцію.,
