Різниця між флуоресцентним мікроскопом і звичайним мікроскопом
1. Подивіться на метод освітлення
Метод освітлення флуоресцентного мікроскопа, як правило, є епі-типом, тобто джерело світла розміщується на досліджуваному зразку через лінзу об’єктива.
2. Подивіться на дозвіл
Флуоресцентні мікроскопи використовують ультрафіолетове світло як джерело світла з відносно короткою довжиною хвилі, але роздільна здатність вища, ніж у звичайних оптичних мікроскопів.
3, різниця у фільтрі
Флуоресцентний мікроскоп використовує два спеціальні фільтри, які використовуються перед джерелом світла для фільтрації видимого світла та використовуються між об’єктивом і окуляром для фільтрації ультрафіолетового світла, яке може захистити очі людини.
Флуоресцентний мікроскоп також є різновидом оптичного мікроскопа, головним чином тому, що довжина хвилі, збуджена флуоресцентним мікроскопом, коротка, тому це призводить до різниці в структурі та використанні флуоресцентного мікроскопа та звичайного мікроскопа. Більшість флуоресцентних мікроскопів добре вловлюють слабке світло. , тому за надзвичайно слабкої флуоресценції його здатність до зображення також хороша. У поєднанні з безперервним удосконаленням флуоресцентної мікроскопії в останні роки шум також значно зменшився. Тому все частіше використовуються флуоресцентні мікроскопи.
Знання двофотонної флуоресцентної мікроскопії
Основний принцип двофотонного збудження такий: у разі високої щільності фотонів флуоресцентні молекули можуть поглинати два довгохвильові фотони одночасно, і після дуже короткого так званого часу життя збудженого стану випромінювати короткохвильовий фотон. ; ефект такий самий, як використання фотона з довжиною хвилі, яка вдвічі менша за довгу хвилю, для збудження флуоресцентної молекули. Двофотонне збудження вимагає високої щільності фотонів, і щоб не пошкодити клітини, двофотонна мікроскопія використовує високоенергетичні імпульсні лазери з синхронізованим режимом. Цей лазер випромінює лазерне світло з високою піковою енергією та низькою середньою енергією, із шириною імпульсу лише 100 фемтосекунд і частотою від 80 до 100 МГц. Коли для фокусування фотонів імпульсного лазера використовується об’єктив з високою числовою апертурою, щільність фотонів у фокальній точці лінзи об’єктива є найвищою, а двофотонне збудження виникає лише в фокальній точці лінзи об’єктива, тому двофотонному мікроскопу не потрібне конфокальне отвір, що покращує ефективність виявлення флуоресценції.
У загальному явищі флуоресценції через низьку щільність фотонів збуджуючого світла флуоресцентна молекула може поглинати лише один фотон одночасно, а потім випускати флуоресцентний фотон через перехід випромінювання, який називається однофотонною флуоресценцією. У процесі збудження флуоресценції з лазером як джерелом світла може виникнути двофотонна або навіть багатофотонна флуоресценція. У цей час інтенсивність джерела збудження, що використовується, висока, а щільність фотонів відповідає вимозі, щоб флуоресцентна молекула поглинала два фотони одночасно. У процесі використання загального лазера як джерела світла збудження густини фотонів ще недостатньо для створення двофотонного поглинання. Зазвичай використовується фемтосекундний імпульсний лазер, миттєва потужність якого може досягати порядку мегават. Тому довжина хвилі двофотонної флуоресценції коротша за довжину хвилі збуджуючого світла, що еквівалентно ефекту, спричиненому збудженням довжиною хвилі напівзбудження.
Двофотонна флуоресцентна мікроскопія має багато переваг:
1) Довгохвильове світло менше піддається розсіюванню, ніж короткохвильове світло, і може легко проникати через зразок;
2) Флуоресцентні молекули поза фокальною площиною не збуджуються, так що більше збуджуючого світла може досягати фокальної площини, так що збуджуюче світло може проникати глибше в зразки;
3) Довгохвильове ближнє інфрачервоне світло менш токсичне для клітин, ніж короткохвильове світло;
4) Під час перегляду зразків за допомогою двофотонної мікроскопії фотознебарвлення та фототоксичність присутні лише у фокальній площині. Таким чином, двофотонна мікроскопія більше підходить для перегляду товстих зразків, ніж однофотонна мікроскопія, для перегляду живих клітин або для виконання експериментів з фотовідбілювання з фіксованою точкою.
Знання конфокальної флуоресцентної мікроскопії
Основний принцип конфокальної флуоресцентної мікроскопії: за допомогою точкового джерела світла для освітлення зразка на фокальній площині утворюється невелика світлова пляма з чітко вираженим контуром. складається з дільника променя. Розділювач променя направляє флуоресценцію безпосередньо на детектор. Перед джерелом світла та детектором є отвір-точка, яка відповідно називається точкою освітлення та точкою виявлення. Геометричні розміри обох є однаковими, близько 100-200 нм; по відношенню до світлової плями на фокальній площині, вони є сполученими, тобто світлова пляма проходить через серію лінз і, нарешті, може бути сфокусована на точці освітлення та точці виявлення одночасно. Таким чином, світло з фокальної площини може бути сконцентровано в межах діапазону отвору виявлення, тоді як розсіяне світло зверху або під фокальною площиною блокується з отвору виявлення, і його неможливо відобразити. Зразок точково сканується лазером, а фотопомножувач після виявлення дірки також отримує конфокальне зображення відповідного світла точка за точкою, яке перетворюється на цифровий сигнал і передається на комп’ютер, а потім агрегується на екрану в чітке конфокальне зображення всієї фокальної площини. .
Кожне зображення у фокальній площині насправді є оптичним перерізом зразка, і цей оптичний переріз завжди має певну товщину, також відомий як оптичний зріз. Оскільки інтенсивність світла в фокальній точці набагато більша, ніж у нефокальній точці, а світло нефокальної площини відфільтровується отвором, глибина різкості конфокальної системи приблизно дорівнює нулю, а сканування вздовж Вісь Z може реалізувати оптичну томографію, утворюючи двовимірний оптичний розріз у сфокусованій точці зразка. Поєднуючи сканування площини XY (фокальної площини) зі скануванням осі Z (оптичної осі), шляхом накопичення двовимірних зображень послідовних шарів і обробки спеціальним комп’ютерним програмним забезпеченням можна отримати тривимірне зображення зразка.
Тобто отвір виявлення та отвір джерела світла завжди сфокусовані в одній точці, тому флуоресценція, збуджена за межами площини фокусування, не може потрапити в отвір виявлення.
Просте вираження принципу роботи конфокального лазера полягає в тому, що він використовує лазер як джерело світла, і на основі традиційного зображення флуоресцентного мікроскопа приєднується пристрій лазерного сканування та сполучений фокусуючий пристрій, а також цифрове отримання та обробка зображень. системою керує комп'ютер.
