Різниця між флуоресцентним мікроскопом і звичайним мікроскопом
Нещодавно я спробував зробити кілька заморожених частин мишей. Далі я використаю флуоресцентний мікроскоп, щоб побачити, чи вірус, який я ввів, знаходиться в тій області мозку, яку я хочу. Необхідно коротко вивчити деякі основні принципи флуоресцентної мікроскопії, і я поділюся ними тут.
Флуоресцентні мікроскопи використовують ультрафіолетове світло як джерело світла для освітлення об’єкта, що перевіряється, змушуючи об’єкт випромінювати світло, а потім спостерігати за об’єктом під мікроскопом. В основному використовується для імунофлюоресцентних клітин. В основному він складається з джерела світла, системи фільтрів та оптичної системи. Флуоресцентне зображення зразка спостерігається через збільшення окуляра та лінзи об’єктива. Давайте подивимося, чим відрізняється флуоресцентний мікроскоп від звичайного оптичного мікроскопа.
1. Подивіться на метод освітлення
Метод освітлення флуоресцентного мікроскопа, як правило, є епіосвітленням, що означає, що джерело світла розміщується на досліджуваному зразку через лінзу об’єктива.
2. Подивіться на дозвіл
Флуоресцентні мікроскопи використовують ультрафіолетове світло як джерело світла, яке має коротшу довжину хвилі, але вищу роздільну здатність, ніж звичайні оптичні мікроскопи.
3. Відмінності фільтрів
Флуоресцентні мікроскопи використовують два спеціальні фільтри: один використовується перед джерелом світла для фільтрації видимого світла, а інший використовується між об’єктивом і окуляром для фільтрації ультрафіолетових променів, які можуть захистити очі людини.
Флуоресцентний мікроскоп також є різновидом оптичного мікроскопа. Основна причина полягає в тому, що довжина хвилі, збуджена флуоресцентним мікроскопом, коротка, тому це призводить до різниці в структурі та використанні між флуоресцентним мікроскопом і звичайним мікроскопом. Більшість флуоресцентних мікроскопів добре вловлюють слабке світло. , тому його здатність до зображення також хороша за надзвичайно слабкої флуоресценції. У поєднанні з безперервним удосконаленням флуоресцентних мікроскопів за останні роки рівень шуму також значно зменшився. Тому все частіше використовуються флуоресцентні мікроскопи.
Знання про двофотонну флуоресцентну мікроскопію
Основний принцип двофотонного збудження такий: за умови високої щільності фотонів флуоресцентні молекули можуть поглинати два довгохвильові фотони одночасно, а після короткого так званого часу життя збудженого стану випромінювати фотон з меншою довжиною хвилі. . ;Ефект такий самий, як використання фотона з довжиною хвилі, яка вдвічі менша за довгу, для збудження флуоресцентних молекул. Для двофотонного збудження потрібна висока щільність фотонів. Щоб не пошкоджувати клітини, у двофотонних мікроскопах використовуються високоенергетичні імпульсні лазери з синхронізованим режимом. Цей лазер випромінює лазерне світло з високою піковою енергією та низькою середньою енергією, із шириною імпульсу лише 100 фемтосекунд і частотою від 80 до 100 МГц. При використанні об’єктива з високою числовою апертурою для фокусування фотонів імпульсного лазера щільність фотонів у фокусі лінзи об’єктива є найвищою. Двофотонне збудження відбувається лише у фокусі лінзи об’єктива, тому для двофотонного мікроскопа не потрібне конфокальне отвір, що покращує ефективність виявлення флуоресценції.
У загальному явищі флуоресценції через низьку щільність фотонів збуджуючого світла флуоресцентна молекула може поглинати лише один фотон одночасно, а потім випускати один фотон флуоресценції через радіаційний перехід. Це однофотонна флуоресценція. У процесі збудження флуоресценції з використанням лазера як джерела світла можуть виникнути явища двофотонної або навіть багатофотонної флуоресценції. У цьому випадку інтенсивність джерела збудження світла, що використовується, є високою, а щільність фотонів відповідає вимозі, щоб флуоресцентні молекули поглинали два фотони одночасно. У процесі використання звичайних лазерів як джерел світла збудження щільність фотонів ще недостатня для двофотонного поглинання. Зазвичай використовуються фемтосекундні імпульсні лазери, миттєва потужність яких може досягати рівня мегават. Таким чином, довжина хвилі двофотонної флуоресценції коротша за довжину хвилі збуджуючого світла, що еквівалентно ефекту збудження довжиною хвилі напівзбудження.
