Тенденція розвитку конфокальної мікроскопії
Щоб отримати кращі результати спостереження на технічному рівні, конфокальна мікроскопія зосереджується на вдосконаленні технічного рівня з точки зору покращення роздільної здатності, зменшення фототоксичності, збільшення швидкості сканування, спостереження за товстими зразками та спостереження in vivo. На даний момент це Z ефективно. Те, що просуває Zda для технології конфокальної мікроскопії, — це мікроскопія надвисокої роздільної здатності, яка долає оптичну межу та дозволяє дослідникам отримувати більш тонкі клітинні структури, що сприяє глибшому розумінню дослідниками життєдіяльності. Наступне дослідження технології конфокальної мікроскопії має бути зосереджено на таких моментах:
1. Більш висока швидкість сканування
На даний момент швидкість конфокального сканування обмежена механічною структурою обладнання для сканування, і роздільною здатністю можна пожертвувати лише для отримання вищої швидкості сканування. Багато біологічних процесів протікають настільки швидко, що їх неможливо виявити.
2. Більш досконала технологія надвисокої роздільної здатності
На даний момент технології надвисокої роздільної здатності включають STORM, PALM, STED і SSIM з роздільною здатністю від 20 до 200 нм, але кожна технологія має певні недоліки, такі як обробка зразків, напрямок осі Z, фототоксичність тощо. не є майже ідеальним, і часто важко досягти граничної роздільної здатності під час фактичного спостереження.
3. Сильніша сумісність
Технологія конфокальної мікроскопії включає різноманітні методи збудження, такі як багатофотонне та світлове спостереження, згадане вище, і когерентне антистоксове комбінаційне розсіювання теоретично може використовувати набір лазерних систем. Мікроскопію з високою роздільною здатністю можна поєднати з білою лазерною технологією. Однак через проблеми з патентами різних компаній все ще є місце для вдосконалення з точки зору повноти та сумісності, а поточне обладнання не може повністю відобразити технічні переваги програми.
Принципи конфокальної мікроскопії
Конфокальний мікроскоп складається з чотирьох частин: оптичної системи мікроскопа, лазерного джерела світла, сканера та системи виявлення та обробки. Він використовує лазер з хорошою когерентністю як джерело світла. Він використовує принцип сполученого фокусування та пристрій на основі традиційного оптичного мікроскопа та використовує комп’ютерну систему спостереження, аналізу та виведення для обробки зображень.
Лазерний скануючий промінь проходить через отвір решітки, утворюючи точкове джерело світла, яке відбивається до лінзи об’єктива через розсіювач променя, фокусується на зразку та сканується. Після того, як зразок збуджується, випромінювана флуоресценція повертається до спектроскопа та збирає її до отвору детектування, а потім фотоелектронним помножувачем перетворює її в електричний сигнал і передає на комп’ютер для відображення чіткого зображення фокальної площини. Збуджувальне світло фокусується на зразку через отвір ґратки, а флуоресценція фокусується на отвір через лінзу об’єктива. Цей процес утворює дві фокусування, тому його називають конфокальним мікроскопом.
Звичайні біологічні зразки мають складну структуру і певну товщину. При спостереженні за допомогою звичайного флуоресцентного мікроскопа флуоресценція, випромінювана зразком, накладається одна на одну, і роздільна здатність зображення значно знижується.
Конфокальне зображення конфокального мікроскопа може ефективно пригнічувати потрапляння розсіяного світла та світла, не пов’язаного з вимірюванням, за межами фокальної площини в детектор, створювати зображення в одній фокальній площині та значно покращувати роздільну здатність. Коли столик рухається рівномірно в горизонтальному напрямку, він може сформувати чітке одношарове зображення, а у вертикальному напрямку він може реалізувати пошарове сканування зразка на різній глибині та отримати тривимірну структуру зразка після тривимірної реконструкції, яка є так званим «оптичним КТ». Зразок мітять флуоресцентним зондом, а потім спостерігають за допомогою конфокального мікроскопа. Можна не тільки спостерігати різні фіксовані клітини та тканинні структури, але також можна якісно та кількісно спостерігати та регулярно вимірювати морфологію, структуру та іони живих клітин.
