Визначення кількості мікроорганізмів - прямий лічильний метод мікроскопа!
Зростання бактеріальної популяції проявляється збільшенням кількості клітин або збільшенням клітинної маси. Методи визначення кількості клітин включають метод прямого підрахунку під мікроскопом, метод підрахунку колоній на чашці, метод фотоелектричного масляного співвідношення, метод максимальної ймовірності та метод мембранної фільтрації. Методи вимірювання вмісту клітинної речовини включають визначення сухої маси клітини, визначення певних клітинних компонентів, таких як вміст азоту, РНК і ДНК, а також визначення метаболітів. Коротше кажучи, існує багато методів вимірювання росту мікроорганізмів, кожен зі своїми перевагами та недоліками, і їх слід обирати відповідно до конкретної ситуації. Цей експеримент в основному представляє метод прямого підрахунку під мікроскопом, який зазвичай використовується у виробництві та наукових дослідженнях.
1. Цільові вимоги
1. З’ясуйте принцип підрахунку клітин крові.
2. Оволодіти методикою підрахунку мікроорганізмів за допомогою лічильника клітин крові.
2. Основні принципи
Метод прямого підрахунку під мікроскопом – це простий, швидкий та інтуїтивно зрозумілий метод прямого підрахунку невеликої кількості суспензії зразка, який потрібно перевірити, на спеціальному предметному склі з певною площею та об’ємом (також відомий як лічильник бактерій). методи. Зараз широко використовувані лічильники бактерій у країні та за кордоном: дошка для підрахунку клітин крові, лічильник бактерій Peteroff-Hauser та лічильник бактерій Hawksley тощо. Вони можуть використовуватися для підрахунку дріжджів, бактерій, спор цвілі та інших суспензій, а також основний принцип той самий. Останні два типи лічильників бактерій мають загальний об’єм 0.02 мм3 після покриття покривним склом, а відстань між покривним склом і предметним склом становить лише 0,02 мм, тому масло імерсійний об’єктив можна використовувати для спостереження та спостереження за дрібними клітинами, такими як бактерії. рахувати. Крім цих бактеріометрів, існує також метод оцінки відношення площі мазка до площі поля зору, що спостерігається безпосередньо під мікроскопом, який зазвичай використовують для бактеріологічного дослідження молока. Перевагами методу прямого підрахунку мікроскопа є інтуїтивно зрозумілий, швидкий і простий у використанні. Однак недоліком цього методу є те, що виміряний результат зазвичай є сумою мертвих і живих клітин. В даний час існують деякі методи подолання цього недоліку, такі як поєднання мікрокамерної культури з фарбуванням життєздатних бактерій (короткий час) і додавання інгібіторів поділу клітин для досягнення мети підрахунку лише життєздатних бактерій.
У цьому експерименті гемоцитометр використовувався як приклад для прямого мікроскопічного підрахунку. Для використання інших двох типів лічильників бактерій див. інструкції кожного виробника. Підрахунок мікроорганізмів безпосередньо під мікроскопом за допомогою гемоцитометра є широко використовуваним методом підрахунку мікроорганізмів. Рахункова пластина являє собою спеціальне предметне скло, на якому чотирма прорізами утворено три майданчики; ширша платформа посередині розділена на дві половини коротким поперечним прорізом, а з боків платформи є сітка. Кожна сітка поділена на дев'ять великих квадратів, і великий квадрат посередині є кімнатою для підрахунку. Структура планшета для підрахунку клітин крові показана на малюнку 1{{{{10}}}}. Шкала лічильної кімнати зазвичай має дві специфікації: одна — це великий квадрат, поділений на 25 середніх квадратів, а кожен середній квадрат поділений на 16 малих квадратів (Малюнок 15-2); інший — великий квадрат. Квадрат поділений на 16 середніх квадратів, а кожен середній квадрат поділений на 25 малих квадратів, але незалежно від того, яка це дошка для підрахунку, у кожному великому квадраті є 400 малих квадратів. Довжина сторони кожного великого квадрата дорівнює 1 мм, а площа кожного великого квадрата — 1 мм2. Після накриття покривним склом висота між покривним і предметним склом становить 0,1 мм, тому об’єм лічильної камери становить 0,1 мм3 (одна тисячна мілілітра). Рисунок 15-1 Структура таблички для підрахунку клітин крові (1) Рисунок 15-2 Структура панелі для підрахунку клітин крові (2) A. Вид спереду; Б. Поздовжній розріз; Збільшена сітка, великий квадрат посередині є лічильною камерою 1. Клітини крові Лічильна пластина; 2. Покривне скло; 3. Під час підрахунку в лічильній камері зазвичай підраховують загальну кількість бактерій у п’яти квадратах, потім обчислюють середнє значення кожного квадрата та множать на 25 або 16, щоб отримати загальну кількість бактерій у великому квадраті, а потім перетворюють на загальна кількість бактерій в 1 мл розчину бактерій. Нехай загальна кількість бактерій у п’яти квадратах дорівнює A, а коефіцієнт розведення бактеріального розчину – B. Якщо це лічильна пластина з 25 квадратами, загальна кількість бактерій в 1 мл бактеріального розчину {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(шт.) Так само, якщо це лічильна пластина з 16 середніми квадратами, загальна кількість бактерій в 1 мл розчину бактерій=A/ 5×16×104×B=32000A·B (шт.)
3. Обладнання
1. Бактерії
Saccharomyces cerevisiae
2. Інструменти або інший посуд
Гемоцитометр, мікроскоп, покривне скло, стерильна капілярна крапельниця.
4. Етапи операції
1. Приготування бактеріальної суспензії
Saccharomyces cerevisiae готували бактеріальну суспензію відповідної концентрації на стерильному фізіологічному розчині.
2. Лічильна кімната мікроскопа
Перед додаванням зразків огляньте під мікроскопом лічильну камеру лічильної пластини. Якщо є забруднення, їх потрібно очистити і висушити перед підрахунком.
3. Додайте зразок
Накрийте чистий і сухий гемоцитометр накривним склом, а потім за допомогою стерильної капілярної крапельниці капніть невелику краплю збовтаної суспензії Saccharomyces cerevisiae з краю накривного скельця та дозвольте бактеріальному розчину автоматично рухатися вздовж щілини шляхом капілярного осмосу. Входячи в кімнату підрахунку, загальна кімната підрахунку може бути заповнена бактеріальною рідиною. При відборі спочатку збовтайте бактеріальний розчин; при додаванні зразків у лічильній камері не повинно утворюватися бульбашок повітря.
4. Рахунковий мікроскоп
Після додавання зразка затримайтеся на 5 хвилин, потім помістіть гемоцитометр на столик мікроскопа, спочатку знайдіть розташування лічильної камери за допомогою малопотужного мікроскопа, а потім переключіться на потужний мікроскоп для підрахунку. Налаштуйте належним чином інтенсивність світла мікроскопа. Для мікроскопів, які використовують дзеркала для освітлення, зверніть увагу на те, щоб не відхилятися від одного боку світла, інакше буде важко чітко побачити квадратні лінії лічильної кімнати в полі зору, або будуть лише вертикальні лінії або горизонтальні лінії бути побаченим. Якщо виявлено, що бактеріальний розчин занадто концентрований або занадто розведений перед підрахунком, необхідно відкоригувати розведення перед підрахунком. Як правило, для розведення зразка потрібно приблизно від 5 до 10 бактерій у кожній маленькій клітині. Кожна лічильна камера вибирає 5 середніх комірок (опціонально 4 кути та одну середню комірку в центрі) для підрахунку. Клітини, розташовані на лінії сітки, як правило, підраховуються лише у верхній і правій лініях. У разі брунькування дріжджів, коли розмір бруньки досягає половини материнської клітини, її зараховують як дві бактеріальні клітини. Щоб підрахувати зразок, обчисліть вміст бактерій у зразку, обчисливши середнє значення з двох лічильних камер.
5. Промийте клітинний аналіз крові
Після використання промийте табличку для підрахунку кров’яних тілець водою під краном, не тріть твердими предметами, а після миття висушіть її самостійно або за допомогою фена. Мікроскопічне дослідження для виявлення залишкових бактерій або інших відкладень у кожній маленькій клітині. Якщо він нечистий, його потрібно багаторазово мити, поки він не стане чистим.
