Основна структура конфокальної флуоресцентної мікроскопії
(1) Модуль сканування
Модуль сканування в основному складається зі світлової панелі-обскури (контролює товщину оптичних зрізів), спектроскопа (змінює напрямок поширення світла відповідно до довжини хвилі), емісійного флуоресцентного колориметра (вибирає світло в певному діапазоні довжин хвиль для виявлення) і детектор (фотоелектронний помножувач). Змішана флуоресценція у флуоресцентному зразку надходить у сканер, і після того, як її вибирають світловий рядок з отворами виявлення, спектрометр і колориметр, вона поділяється на різні монохроматичні флуоресценції, які виявляються в різних флуоресцентних каналах і утворюють відповідні конфокальні зображення. Одночасно на екран комп'ютера можна виводити кілька паралельних монохроматичних флуоресцентних зображень і їх складені зображення.
(2) Система флуоресцентної мікроскопії
Мікроскоп є основним компонентом LSCM, який пов’язаний із якістю зображення системи. Оптичний шлях мікроскопа можна легко вставити в нескінченно віддалену оптичну систему з оптичними опціями, не впливаючи на якість зображення та точність вимірювань. Об’єктив має бути плоскопольним апохроматичним об’єктивом із великою числовою апертурою, який є корисним для отримання флуоресценції та чіткого зображення. Перетворенням групи лінз об’єктива, вибором групи кольорових фільтрів, регулюванням руху предметного столика та блокуванням пам’яті фокальної площини має автоматично керувати комп’ютер.
Флуоресцентний мікроскоп, який використовується в лазерній скануючій конфокальній мікроскопії, загалом такий самий, як і звичайний флуоресцентний мікроскоп, але він має свої особливості: його потрібно підключити до сканера, щоб лазер міг увійти в об’єктив мікроскопа, опромінити зразок і зробити флуоресценція, випромінювана зразком, досягає детектора; Потрібен пристрій для перетворення шляху світла, який перетворює ртутні лампи на лазери, і інтенсивність світла ртутної лампи можна регулювати.
(3) Звичайні лазери
Лазерні джерела, що використовуються в лазерній скануючій конфокальній мікроскопії, включають однолазерні та багатолазерні системи, і зазвичай використовувані лазери включають такі три типи:
Напівпровідниковий лазер: 405 нм (біля ультрафіолетової спектральної лінії)
Аргоновий іонний лазер: 457 нм, 477 нм, 488 нм, 514 нм (синьо-зелене світло)
He-Ne лазер: 543 нм (зелений He-Ne лазер) 633 нм (червоний He-Ne лазер)
УФ-лазер (УФ-лазер): 351 нм, 364 нм (УФ-світло)
(4) Допоміжне обладнання
Системи охолодження з повітряним, водяним охолодженням і регульовані джерела живлення.
Основний принцип роботи лазерного скануючого конфокального мікроскопа полягає у випромінюванні лазером збуджуючого світла певної довжини хвилі. Після посилення світло проходить через освітлену світлову смугу-обскуру в сканері, утворюючи точкове джерело світла. Лінза об’єктива фокусується на фокальній площині зразка, а відповідні освітлені точки на зразку збуджуються та випромінюють флуоресценцію. Пройшовши світлову смугу отвору виявлення, вона досягає детектора та відображається на екрані моніторингу комп’ютера. Таким чином повне конфокальне зображення формується за допомогою флуоресцентних зображень кожної точки зразка на фокальній площині, яке називається світловим зрізом.
