Практичні знання конфокальної флуоресцентної мікроскопії
Основний принцип конфокальної флуоресцентної мікроскопії: використовуйте точкове джерело світла, щоб освітлити зразок, щоб утворити невелику, чітко визначену світлову пляму на фокальній площині. Флуоресценція, випромінювана плямою після освітлення, збирається лінзою об’єктива та повертається до дихроїчного дзеркала вздовж початкового шляху освітлення. являють собою розсіювач променя. Спектрометр надсилає флуоресценцію безпосередньо на детектор. Перед джерелом світла та детектором є отвір, який називається отвором для освітлення та отвором для виявлення відповідно. Геометричні розміри обох узгоджені, близько 100-200 нм; по відношенню до світлової точки на фокальній площині, вони є сполученими, тобто світлова точка проходить через серію лінз і в кінцевому підсумку може бути сфокусована на точці освітлення та точці виявлення одночасно. Таким чином, світло з фокальної площини може бути сконцентровано в межах діапазону отвору виявлення, тоді як розсіяне світло зверху або під фокальною площиною блокується за межами отвору виявлення і не може бути зображено. Зразок точково сканується лазером, а фотопомножувач за отвором детектування також отримує конфокальне зображення відповідного світла точково, яке перетворюється на цифровий сигнал і передається на комп’ютер, а потім агрегується на екрану в чітке конфокальне зображення всієї фокальної площини. .
Кожне зображення фокальної площини насправді є оптичним перерізом зразка. Цей оптичний переріз завжди має певну товщину і називається також оптичним зрізом. Оскільки інтенсивність світла у фокусі набагато більша, ніж інтенсивність світла в нефокусній зоні, а світло нефокальної площини фільтрується отвором, глибина різкості конфокальної системи приблизно дорівнює нулю. Сканування вздовж осі Z може реалізувати оптичну томографію, формуючи бажаний двовимірний оптичний розріз у сфокусованій точці зразка. Поєднуючи сканування площини XY (фокальної площини) зі скануванням осі Z (оптичної осі), шляхом накопичення безперервних рівнів двовимірних зображень та їх обробки за допомогою спеціального комп’ютерного програмного забезпечення, можна отримати тривимірне зображення зразка.
Тобто отвір виявлення та отвір джерела світла завжди сфокусовані в одній точці, тому флуоресценція, збуджена за межами площини фокусування, не може потрапити в отвір виявлення.
Просте вираження принципу роботи конфокального лазера полягає в тому, що він використовує лазер як джерело світла. На основі традиційної флуоресцентної мікроскопічної візуалізації додано лазерний скануючий пристрій і сполучений фокусуючий пристрій, а системою керує комп’ютер для збору та обробки цифрових зображень.
