Огляд кількох методів мікроскопії з високою роздільною здатністю
Для звичайної світлової мікроскопії дифракція світла обмежує роздільну здатність зображення до приблизно 250 нм. Сьогодні методи надвисокої роздільної здатності можуть покращити це більш ніж у 10 разів. Ця техніка в основному досягається трьома методами: одномолекулярна локалізаційна мікроскопія, включаючи фоточутливу локалізаційну мікроскопію (PALM) і стохастичну оптичну реконструкцію мікроскопії (STORM); мікроскопія зі структурованим освітленням (SIM); і стимульована мікроскопія виснаження випромінювання (STED). Як вибрати технологію надвисокої роздільної здатності – це те, що хвилює кожного. «На жаль, немає простих принципів, за допомогою яких можна вирішити, який метод використовувати», — каже Метью Стрейсі, докторант Оксфордського університету, Великобританія. «У кожного є свої переваги та недоліки». Звичайно, вчені також з’ясовують, як вибрати правильний метод для конкретного проекту. «У контексті біовізуалізації ключові фактори, які слід враховувати, включають: просторову та часову роздільну здатність, чутливість до фотопошкодження, здатність до маркування, товщину зразка та фонову флуоресценцію або клітинну аутологічну флуоресценцію». Як це працює? Різні мікроскопи з високою роздільною здатністю працюють по-різному. У випадку PALM і STORM лише невелика частка флуоресцентних маркерів збуджується або фотоактивується в даний момент, що забезпечує їх незалежну локалізацію з високою точністю. Проходження цього процесу з усіма флуоресцентними мітками призводить до повного зображення надвисокої роздільної здатності. Штефан Гелл, один із лауреатів Нобелівської премії з хімії 2014 року та директор Інституту біофізичної хімії Макса Планка, сказав: «Систему PALM/STORM відносно легко встановити, але її важко застосувати, оскільки флуоресцентні група повинна мати здатність до фотоактивації. Обмеження. Недоліком є те, що їм потрібно виявити одну флуоресцентну молекулу в контексті клітини, і вони менш надійні, ніж STED. STED використовує лазерний імпульс для збудження флуорофора та кільцевий лазер для гасіння флуорофора, залишаючи лише проміжну флуоресценцію нанометрового розміру для суперроздільності. Сканування всього зразка створює зображення. «Перевага STED полягає в тому, що це кнопкова технологія», — пояснив Хелл. «Він працює як стандартний конфокальний флуоресцентний мікроскоп». Він також може відображати живі клітини за допомогою флуорофорів, таких як зелені або жовті флуоресцентні білки та родамінові барвники. Параметричне порівняння Хоча всі методи надвисокої роздільної здатності перевершують звичайну світлову мікроскопію за роздільною здатністю, вони відрізняються одна від одної. SIM приблизно подвоює роздільну здатність приблизно до 100 нм. PALM і STORM можуть розрізняти цілі 15 нм. За словами Хелла, STED забезпечує просторову роздільну здатність 30 нм у живих клітинах і 15 нм у фіксованих клітинах. Коли справа доходить до конкретних застосувань, ми також повинні враховувати співвідношення сигнал/шум. У деяких випадках нижча роздільна здатність, але вищий SNR може призвести до кращого зображення, ніж навпаки (вища роздільна здатність, але нижчий SNR). Швидкість отримання зображення також дуже важлива, особливо для живих клітин. «Усі методи високої роздільної здатності працюють повільніше, ніж звичайні методи флуоресцентної візуалізації», — сказав Страсі. «PALM/STORM є найповільнішим, йому потрібні десятки тисяч кадрів для отримання одного зображення, SIM потрібні десятки кадрів, а STED є технологією сканування, тому швидкість отримання залежить від розміру поля зору». Крім живих клітин або фіксованих клітин візуалізації, деякі вчені також хочуть зрозуміти, як рухаються об'єкти. Стрейсі зацікавлений у розумінні динаміки біологічних систем у живих клітинах, а не лише в статичних зображеннях. Він поєднує PALM із відстеженням окремих частинок для аналізу динаміки живих клітин. Таким чином він може безпосередньо відстежувати молекули-маркери, коли вони виконують свої функції. Однак він вважає, що SIM не підходить для вивчення цих динамічних процесів на молекулярному рівні, але через його швидку швидкість отримання він особливо підходить для спостереження за динамікою більших структур, таких як цілі хромосоми. Останні результати У 2017 році команда Hell повідомила про мікроскоп із надвисокою роздільною здатністю MINFLUX у журналі Science. За словами Хелла, цей метод супер-роздільності вперше досягає просторової роздільної здатності 1 нм. Крім того, він може відстежувати окремі молекули в живих клітинах принаймні в 100 разів швидше, ніж інші методи. Інші вчені також високо відгукувалися про мікроскоп MINFLUX. «Постійно розробляються нові програми та підходи, але для мене впадають у вічі два досягнення», — сказав Шехтман. Одним з них є MINFLUX. «Він використовує геніальний підхід для отримання дуже точного молекулярного позиціонування». Щодо другої захоплюючої події Шехтман згадав WE Moerner та його колег зі Стенфордського університету. Моернер також був лауреатом Нобелівської премії з хімії 2014 року. Один із переможців. Щоб усунути обмеження роздільної здатності зображення, викликане анізотропним розсіюванням флуоресцентних окремих молекул, вчені використовували різні поляризації збудження для визначення орієнтації та положення молекул. Крім того, вони мають тонкі поверхні зіниць. Ці методи покращують здатність локалізувати структури. Про флуоресцентні мітки У багатьох програмах із високою роздільною здатністю мітки справді мають значення. Є також деякі компанії, які пропонують супутні товари. Наприклад, німецька Miltenyi об’єдналася з Abberior, компанією, заснованою Стефаном Хеллом, щоб надати спеціальні послуги з кон’югації антитіл для мікроскопічних барвників із високою роздільною здатністю. Ряд інших компаній також пропонують відповідні маркери. «Наші нанобустери дуже малі, лише 1,5 кДа, і дуже специфічні», — каже Крістоф Екерт, маркетинговий співробітник ChromoTek. Ці білки зв'язують зелені та червоні флуоресцентні білки (GFP і RFP). Вони отримані з фрагментів антитіл альпаки, відомих як VHH або нанотіла, з чудовими зв’язуючими властивостями та стабільною якістю без варіацій від партії до партії. Ці маркери підходять для різних методів надвисокої роздільної здатності, включаючи SIM, PALM, STORM і STED. Ай-Хуй Тан, доцент Медичної школи Університету Меріленда, і його колеги використовували GFP-Booster і STORM від ChromoTek для дослідження поширення інформації в нервовій системі. Вони знайшли молекулярні нанокластери, які називаються наноколонками, у пресинаптичних і постсинаптичних нейронах. Вчені вважають, що ця структура показує, що центральна нервова система використовує прості принципи для підтримки та регулювання синаптичної ефективності. Різні версії зображень із надвисокою роздільною здатністю та зростаюча кількість методів занурюють вчених ще глибше в біологічні таємниці. Порушуючи межу дифракції видимого світла, біологи можуть навіть «уважно стежити» за діями клітин.
